吡蟲啉在生菜中的吸收遷移及轉化行為

劉倩宇 李遠播 董豐收 劉新剛 徐軍 吳小虎 鄭永權 劉穎超

摘要 為了探究吡蟲啉在植物中的吸收轉運規律，本研究選擇生菜為研究對象，將其在含有1 mg/kg吡蟲啉的水培液中持續暴露120 h，利用超高效液相色譜三重四極桿質譜檢測吡蟲啉及其5種代謝物在生菜不同部位動態吸收變化和轉運分布規律。結果表明，吡蟲啉在葉部富集程度明顯高于根部，當達到吸收穩定狀態時，吡蟲啉在葉部富集程度約為根部的6倍。吡蟲啉在生菜中的吸收和代謝是同步進行的，代謝物在生菜葉部的富集程度排序為：吡蟲啉烯烴>5-羥基吡蟲啉>4，5-二羥基吡蟲啉>6-氯煙酸>吡蟲啉脲，代謝物在葉部富集高于根部。結果表明吡蟲啉從根部向地上部遷移能力較強，根部施用吡蟲啉可有效防治葉部害蟲。本研究為吡蟲啉的科學使用，保障農產品的質量安全提供了必要的數據支持。

關鍵詞 吡蟲啉; 生菜; 吸收; 轉化

中圖分類號： X592

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021070

Abstract In order to explore the uptake and translocation of imidacloprid in plants， lettuce was exposed to 1 mg/kg of imidacloprid in hydroponic solution for 120 h. The uptake and translocation of imidacloprid and its five metabolites in lettuce were determined by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The results showed that the accumulation of imidacloprid in leaves was significantly higher than that in roots. When reaching uptake quasi-equilibrium， the accumulation of imidacloprid in leaves was about six times of that in roots. The uptake and metabolism of imidacloprid in lettuce co-occurred， and the concentrations of metabolites in leaves ranked from high to low as followed： imidacloprid-olefin， 5-hydroxy-imidacloprid，4，5-dihydroxy-imidacloprid， 6-chloronicotinic acid， and imidacloprid-urea. The concentration of metabolites in leaves was higher than that in roots. These results suggested that imidacloprid had a better translocation ability from roots to the aboveground， and thus application in roots could effectively prevent and control leaf insect pests. This research provided essential data to support the scientific use of imidacloprid and ensure the quality and safety of agricultural products.

Key words imidacloprid; lettuce; uptake; transformation

吡蟲啉是拜耳公司生產的首個氯代煙堿殺蟲劑，通過作用于昆蟲的乙酰膽堿受體，擾亂神經活動達到殺蟲效果，具有觸殺和胃毒雙重作用[1]。作為全球首個商品化的新煙堿殺蟲劑，自1991年投放市場以來，已在120多個國家登記使用[23]。因其具有高水溶性和優良的內吸傳導性，除噴霧施用外，吡蟲啉也常用于種子及土壤處理[45]。與葉面施藥不同的是，吡蟲啉施用于土壤并被植物吸收，會代謝成具有殺蟲活性的化合物，且代謝完全取決于植物種類和時間[67]。因此，研究吡蟲啉在植物體內的吸收轉運規律對其合理使用和農產品安全評價有著重要意義。

生菜是一種重要的全球內廣泛種植的蔬菜，2016年生菜全球總產量超過2 500萬t，其營養價值較高，不僅味道鮮美，還具有改善腸胃功能、護肝、降脂等藥用功效[810]。近年來，生菜成為水培蔬菜的主要栽培品種[11]。在其生長過程中時常受到蚜蟲的威脅，為保證生菜的產量不可避免地會使用農藥[12]。吡蟲啉可有效抑制蚜蟲的發生。然而，對于吡蟲啉研究大多關注于其環境毒理和殘留監控，對于其在水培蔬菜中的吸收代謝報道較少[1315]。為全面了解吡蟲啉對水培蔬菜的安全風險，本研究探究了吡蟲啉在水培生菜中的吸收轉運行為及其代謝物的分析，以期為水培蔬菜上吡蟲啉的合理使用和安全評價提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試標準品99%吡蟲啉，98.7%吡蟲啉烯烴，99.7%吡蟲啉脲，98% 5-羥基吡蟲啉，98% 4，5-二羥基吡蟲啉，99.2% 6-氯煙酸，購自北京金天然科技發展有限公司;供試植物為‘羅馬生菜’，種子購自中蔬種業科技（北京）有限公司;氯化鈉、無水硫酸鎂、甲酸、乙腈，國藥集團化學試劑有限公司;N-丙基乙二胺（PSA，40 μm）、石墨化炭黑（GCB，40 μm）、Filter Unit濾膜（0.22 μm），天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 試驗設計

生菜種子以蛭石為基質進行育苗，待生菜長出2片真葉后，洗去蛭石，將其移入霍格蘭營養液（四水硝酸鈣945 mg/L，硝酸鉀506 mg/L，硝酸銨80 mg/L，磷酸二氫鉀136 mg/L，硫酸鎂493 mg/L，七水硫酸亞鐵5.56 g/L，乙二胺四乙酸二鈉7.46 g/L，碘化鉀0.83 g/L，硼酸6.2 mg/L，硫酸錳22.3 mg/L，硫酸鋅8.6 mg/L，鉬酸鈉0.25 mg/L，硫酸銅0.025 mg/L，氯化鈷0.025 mg/L）中，待生菜生長至6葉期，轉移到1 L含1 mg/kg吡蟲啉的霍格蘭營養液中進行暴露試驗，同時設置不含吡蟲啉的對照組和不含生菜的對照組。培養條件：光周期L∥D=16 h∥8 h，光照強度250 μmol/（m2·s），溫度為25℃，相對濕度為60%，pH為6.5。分別在暴露后2、6、12、24、48、72、96 h和120 h后采集樣品，各3個重復。用蒸餾水沖洗根部表面的吡蟲啉殘留，用濾紙吸干后，將每個植株分割為根部和葉部，放置于-20℃冰箱保存，待測。

1.3 測定方法

提取：準確稱取生菜根或葉均質樣品1.00 g，并量取水培液樣品1 mL，置于10 mL聚四氟乙烯離心管中，加入2 mL質量濃度1%的甲酸乙腈，以2 500 r/min渦旋提取10 min。然后加入1.0 g NaCl，以2 500 r/min渦旋5 min，最后以4 000 r/min離心5 min，待凈化。水培液樣品上清液直接過0.22 μm有機濾膜，無需凈化。

凈化：對于根部樣品，移取1.2 mL離心后的上清液（乙腈層）至裝有50 mg PSA+150 mg無水硫酸鎂的2 mL離心管中;對于葉部樣品，移取1.2 mL離心后的上清液（乙腈層）至裝有50 mg PSA+10 mg GCB+150 mg無水硫酸鎂的2 mL離心管中，2 500 r/min 渦旋1 min，再以5 000 r/min 離心5 min后，將凈化過的上清液過0.22 μm有機濾膜，待UPLC-MS/MS檢測。

檢測：采用超高效液相色譜三重四極桿質譜聯用儀ACQUITY UPLC-TQS（Waters公司）進行樣品檢測，采用電噴霧離子源，正離子電離模式（ESI+），其中離子源溫度150℃，毛細管電壓3.5 kV，去溶劑溫度500℃，去溶劑氣（N2）流量650 L/h，錐孔反吹氣（N2）流量50 L/h。采用多重反應監測（MRM），具體參數見表1。色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;柱溫：30℃;流動相：0.2%甲酸水溶液、乙腈：流速0.3 mL/min;進樣量：5 μL;梯度洗脫條件見表2。

1.4 數據分析

吡蟲啉在生菜中的吸收速率：

式中，k為單位時間的吸收速率常數[μg/（kg·h）]，ta和tb為時刻a和b，Ca、Cb分別表示吡蟲啉在a和b時刻在生菜中的累積量。

吡蟲啉在生菜中的富集程度，用根部富集系數和轉運系數來表示：

式中，RCF為根部富集系數（root concentration factor，RCF），TF為轉運系數（translocation factor，TF），Cwater為吡蟲啉在水培液中的含量（μg/L），Croot為吡蟲啉在根部的含量（μg/kg）。Cleaf為吡蟲啉在葉部的含量（μg/kg）。

數據采用Excel 2019處理，并用Origin 2017作圖。

2 結果與分析

2.1 建立吡蟲啉及其代謝物UPLC-MS/MS檢測方法

采用1.3的檢測方法，濃度在0.005～1 mg/L范圍內吡蟲啉及其代謝物的峰面積與其濃度均呈現良好的線性關系，決定系數R2均大于0.99。在水培液中添加0.005，0.05 mg/L和5 mg/L吡蟲啉及其代謝物，在生菜根和葉中分別添加0.005，0.05 mg/kg和5 mg/kg吡蟲啉及其代謝物，其添加回收率均在85.51%～103.01%，相對標準偏差為6.13%～18.31%。符合農藥殘留分析條件。吡蟲啉及其代謝物在各基質中的定量限（limit of quantitation，LOQ）為0.005 mg/kg。

2.2 生菜不同部位吡蟲啉的吸收和累積動態

生菜對吡蟲啉的吸收動態如圖1所示。初始暴露2 h時，吡蟲啉在根部累積量為（471.16±19.14） μg/kg，6～12 h，吡蟲啉在根部的吸收速率k達到最大，為19.88 μg/（kg·h），隨后吸收速率逐漸降低。在2～120 h內，吡蟲啉在根部累積量為142.87～516.15 μg/kg，在120 h的累積量達到最大。在葉部，吡蟲啉的富集程度隨暴露時間增加逐漸升高，在120 h的累積量達到最大，為（3 098.75±114.82） μg/kg。在72～96 h吡蟲啉在生菜葉部的吸收速率最大，為73.13 μg/（kg·h）， 是根部最大吸收速率的3.68倍。在120 h吡蟲啉在葉部殘留累積量為根部的6倍。

2.3 吡蟲啉在生菜中的富集和轉運

吡蟲啉在生菜不同部位的富集和轉運能力由根部富集系數和轉運系數來表征。如表3所示，吡蟲啉的根部富集系數和轉運系數隨暴露時間的增加整體表現為逐漸增高。然而，在暴露時間少于120 h時根部富集系數均小于1。0～120 h根部富集系數在0.23～1.00之間;轉運系數范圍為0.06～6.83，在暴露時間少于24 h時轉運系數均小于1，隨后轉運系數大于2。吡蟲啉在生菜中吸收和轉運在暴露96 h時達到相對穩定狀態，平衡后的RCF≈1，TF>6。

2.4 吡蟲啉5種代謝物的動態變化

吡蟲啉在生菜中的代謝途徑如圖2所示。5種代謝物在生菜中隨時間的動態變化如圖3所示。吡蟲啉脲在根部未檢出但在葉部有檢出。在根部檢測到的4個代謝物的累積量表現為先降低后升高最后趨于穩定的特征。在葉部，代謝物吡蟲啉烯烴、5-羥基吡蟲啉、4，5-二羥基吡蟲啉和6-氯煙酸的累積量均隨時間增加逐漸升高，而吡蟲啉脲則是呈現先升高，隨后逐漸降低并趨于穩定。吸收達到相對穩定狀態時（96～120 h），相對于其他代謝產物，吡蟲啉烯烴在根部和葉部富集程度均為最大。在生菜根部，4種代謝物吡蟲啉烯烴、4，5-二羥基吡蟲啉、6-氯煙酸和5-羥基吡蟲啉累積量分別是10.77～12.73、7.44～10.50、5.71～6.14 μg/kg和4.32～6.81 μg/kg。在葉部5種代謝物吡蟲啉烯烴、4，5-二羥基吡蟲啉、6-氯煙酸、5-羥基吡蟲啉和吡蟲啉脲累積量分別為11.75～29.66、13.64～17.42、7.28～14.82、8.47～23.43 μg/kg和7.67～11.01 μg/kg。

3 討論

本研究建立了吡蟲啉及其5種主要代謝物在生菜根、葉和水培營養液中的殘留分析方法，LOQ均為0.005 mg/kg，相對于董見南等[16]建立的3種蕓薹屬蔬菜中吡蟲啉殘留分析方法（LOQ為0.02 mg/kg），靈敏度更高。梁秀美等[17]基于QuEChERS方法對茶花花粉中的吡蟲啉及其3種代謝物吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲和6-氯煙酸進行了2次提取。本研究提取方法僅為1次提取，方法簡單，且監測的代謝物更多。

吡蟲啉在生菜各部位中的富集程度隨著暴露時間的增加而升高，在暴露120 h時，吡蟲啉在根部和莖葉部的累積量均達到最大，且在葉部的吸收速率和累積量均大于根部。在水培生菜體系中，吡蟲啉在葉部的累積量約是根部的6倍。吸收穩定時，吡蟲啉的RCF≈1，而TF>6，說明吡蟲啉極易向地上部遷移。農藥的根部吸收被認為是一個被動過程，吡蟲啉具有較強的水溶性，其logKow為0.57，在根部可在極短時間內達到吸收穩態[18]。木質部是農藥遷移和轉運的重要組織，蒸騰拉力是水分等在木質部運輸的主要動力，由于吡蟲啉較高的水溶性，很容易隨蒸騰作用進入木質部進而向葉部轉運[19]。

在本研究中，吡蟲啉代謝物在水培生菜葉部富集程度排序為：吡蟲啉烯烴>5-羥基吡蟲啉>4，5-二羥基吡蟲啉>6-氯煙酸>吡蟲啉脲。Wu等[20]指出灌根條件下，吡蟲啉烯烴在棉花根、莖、葉、花蕾和棉鈴上的累積量遠高于吡蟲啉脲和6-氯煙酸。Juraske等[21]指出相對于莖葉噴霧，根部施藥其在植物中的分布更均勻。吡蟲啉根部施用比莖葉噴霧對蚜蟲和粉虱防治效果更好[2223]。根部施用的吡蟲啉被植物吸收后，可以在植株體內轉化為比母體毒性更高的代謝物[2425]。Dai等[26]提出吡蟲啉烯烴具有比母體更高的殺蟲活性。Nauen等[24]發現吡蟲啉烯烴對棉蚜的胃毒毒性是吡蟲啉母體的16倍。本研究結果表明，5種代謝物中，吡蟲啉烯烴在生菜葉部的富集程度最高，該結果為吡蟲啉生菜害蟲的防治提供理論基礎。

4 結論

本研究在水培條件下探究了吡蟲啉在生菜中的吸收遷移與轉化行為，結果表明吡蟲啉吸收和代謝兩個過程是同時發生的。吡蟲啉具有較強的地上遷移能力，通過根部施用可有效防治葉部害蟲。吡蟲啉對蚜蟲的藥效作用可能是吡蟲啉及其高毒代謝物特別是吡蟲啉烯烴共同作用的結果。吡蟲啉的田間施用可采用低劑量包衣方式，既可以減少農藥的使用量，還可以高效防治葉部害蟲。本研究為吡蟲啉的科學使用，保障農產品的質量安全提供了科學依據。

參考文獻

[1] BAI Donglin， LUMMIS S C R， LEICHT W， et al. Actions of imidacloprid and a related nitromethylene on cholinergic receptors of an identified insect motor neurone [J]. Pesticide Science， 1991， 33（2）： 197204.

[2] 李成名， 聶恩光， 張素芬， 等. 14C-吡蟲啉在苗期油菜中的吸收、轉運與分布特性[J]. 核農學報， 2021， 35（2）： 438446.

[3] 張正煒， 陳秀. 全球范圍內昆蟲對新煙堿類殺蟲劑的抗性現狀[J]. 中國農藥， 2020（8）： 2736.

[4] 王萌， 楊葉， 吉哲蓉， 等. 吡蟲啉和阿維菌素淋溶土壤對蚯蚓及其淋出液對浮萍急性毒性和生理生化指標的影響[J]. 農藥， 2017， 56（6）： 437442.

[5] 楊慶喜， 李東陽， 紀明山， 等. 噴霧和灌根施藥后吡蟲啉在草莓植株中的分布及其對草莓蚜蟲的防效[J]. 植物保護， 2019， 45（4）： 250254.

[6] BENTON E P， GRANT J F， WEBSTER R J， et al. Assessment of imidacloprid and its metabolites in foliage of eastern hemlock multiple years following treatment for hemlock woolly adelgid， adelges tsugae （Hemiptera： Adelgidae）， in forested conditions [J]. Journal of Economic Entomology， 2015， 108（6）： 26722682.

[7] SUR R， STORK A. Uptake， translocation and metabolism of imidacloprid in plants [J]. Bulletin of Insectology， 2003， 56： 3540.

[8] FAO. Food and agriculture data [EB/OL]. [20210201]. http：∥www.fao.org/faostat/.

[9] MAHLANGU R， MABOKO M， SIVAKUMAR D， et al. Lettuce （ Lactuca sativa L.） growth， yield and quality response to nitrogen fertilization in a non-circulating hydroponic system [J]. Journal of Plant Nutrition， 2016， 39： 17661775.

[10]李哲， 王喜山， 趙國臣， 等. 生菜的營養價值及高產栽培技術[J]. 吉林蔬菜， 2014（9）： 1415.

[11]仇玉潔， 李茜， 賀江， 等. 水培蔬菜與傳統蔬菜的品質對比研究[J]. 糧食科技與經濟， 2019， 44（7）： 9598.

[12]BARRIERE V， LECOMPTE F， LESCOURRET F. Efficacy of pest and pathogen control， yield and quality of winter lettuce crops managed with reduced pesticide applications [J]. European Journal of Agronomy， 2015， 71： 3443.

[13]CIMINO A M， BOYLES A L， THAYER K A， et al. Effects of neonicotinoid pesticide exposure on human health： a systematic review [J]. Environmental Health Perspectives， 2017， 125（2）： 155162.

[14]HAN Wenchao， TIAN Ying， SHEN Xiaoming. Human exposure to neonicotinoid insecticides and the evaluation of their potential toxicity： An overview [J]. Chemosphere， 2018， 192： 5965.

[15]PIETRZAK D， KANIA J， KMIECIK E， et al. Fate of selected neonicotinoid insecticides in soil-water systems： current state of the art and knowledge gaps [J/OL]. Chemosphere， 2020， 255： 126981. DOI： 10.1016/j.chemosphere.2020.126981.

[16]董見南， 呂洋， 劉峰， 等. 吡蟲啉在三種蕓薹屬蔬菜中的殘留行為及風險評估[J]. 農藥科學與管理， 2020， 41（8）： 2632.

[17]梁秀美， 王祥云， 汪志威， 等. 茶園花期用藥后蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物殘留的蜜蜂風險評估[J]. 農業環境科學學報， 2018， 37（6）： 11021107.

[18]CHIOU C T， SHENG Guangyao， MANES M. A partition-limited model for the plant uptake of organic contaminants from soil and water [J]. Environmental Science & Technology， 2001， 35（7）： 14371444.

[19]葛國芹. 新煙堿類殺蟲劑在茶樹中的吸收、分布、代謝及互作關系研究[D]. 合肥： 安徽農業大學， 2019.

[20]WU Changcai， DONG Fengshou， MEI Xiangdong， et al. Distribution， dissipation， and metabolism of neonicotinoid insecticides in the cotton ecosystem under foliar spray and root irrigation [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2019， 67（45）： 1237412381.

[21]JURASKE R， CASTELLS F， VIJAY A， et al. Uptake and persistence of pesticides in plants： measurements and model estimates for imidacloprid after foliar and soil application [J]. Journal of Hazardous Materials， 2009， 165： 683689.

[22]BUCHHOLZ A， NAUEN R. Translocation and translaminar bioavailability of two neonicotinoid insecticides after foliar application to cabbage and cotton [J]. Pest Management Science， 2002， 58（1）： 1016.

[23]VAN IERSEL M， OETTING R， HALL D. Imidacloprid applications by subirrigation for control of silverleaf whitefly （Homoptera： Aleyrodidae） on poinsettia [J]. Journal of Economic Entomology， 2000， 93（3）： 813819.

[24]NAUEN R， TIETJEN K， WAGNER K， et al. Efficacy of plant metabolites of imidacloprid against Myzus persicae and Aphis gossypii （Homoptera： Aphididae） [J]. Pesticide Science， 1998， 52（1）： 5357.

[25]范銀君， 史雪巖， 高希武. 新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉和噻蟲嗪的代謝研究進展[J]. 農藥學學報， 2012， 14（6）： 587596.

[26]DAI Yijun， YUAN Sheng， GE Feng， et al. Microbial hydroxylation of imidacloprid for the synthesis of highly insecticidal olefin imidacloprid [J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2006， 71： 927934.

（責任編輯：楊明麗）