熒光定量PCR法在乙型肝炎病毒檢測中的準確性評價

張黎

【摘要】? 目的? ? 分析熒光定量聚合酶鏈式反應法（FQ-PCR）應用在乙型肝炎病毒（HBV）檢測中的準確性。方法? ? 選擇2020年1月—2021年6月接診的100例HBV攜帶者，均行FQ-PCR、酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測，對比二者檢測結果。結果? ? 100例HBV攜帶者中“大三陽（模式1）”共24例，HBV-DNA含量平均為（8.24±1.12）copy/mL，陽性率為95.83%（23/24），均顯著高于其他6種模式（P<0.05）；100例HBV攜帶者中“小三陽（模式2）”共31例，HBV-DNA陽性率為83.87%（26/31），均顯著高于3，4，5，6，7模式（P<0.05）；而其他模式在HBV-DNA陽性率及含量方面均無明顯差異（P>0.05）。結論? ? 與ELISA相比較，FQ-PCR更能定量反映HBV復制、感染狀況，有助于早期確診乙型病毒性肝炎，以及判斷傳染性質與監測病情，值得推廣。

【關鍵詞】? 熒光定量PCR法；乙型肝炎病毒；準確性

中圖分類號：R446.1? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1672-1721（2023）11-0098-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.11.033

乙型病毒性肝炎是臨床常見傳染性疾病，兼具感染率高、傳播途徑復雜、流行面廣等特點[1]。主要因乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）所致，若長期攜帶HBV，容易導致肝臟炎性損傷，甚至誘發肝硬化、肝衰竭、肝細胞癌等疾病。相關報道指出[2]，目前我國乙肝患者數量居全世界首位，極大地威脅著國民健康，故需重視乙肝臨床診療工作。近年來，隨著分子生物技術、免疫學的飛速發展，可以通過聚合酶鏈式反應法（polymerase chain reaction，PCR）、酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等檢測HBV標志物。且有報道指出[3]，ELISA通過測驗HBV表達蛋白的抗體、抗原，能夠診斷乙肝；但是容易受到HBV翻譯、轉錄功能減弱等的干擾，出現假陰性，導致漏診，影響后續治療及預后。而PCR作為新型檢驗技術，通過熒光標記處理HBV-DNA，亦能檢驗HBV- DNA的翻譯及轉錄情況，有助于提高檢驗準確性。本文就熒光定量聚合酶鏈式反應法（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）在HBV檢測中的準確性展開分析，報道如下。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 一般資料? ? 選擇2020年1月—2021年6月接診的100例HBV攜帶者，其中男68例，女32例，年齡23～58歲，平均年齡（41.5±10.8）歲，體重49～77 kg，平均（62.5±4.5）kg。納入標準：（1）在就診中發現HBV；（2）檢查依從性好；（3）知情同意，自愿參加。排除標準：（1）惡性腫瘤疾病者；（2）嚴重內科疾病者；（3）凝血功能障礙者；（4）資料不完善者；（5）溝通、認知、精神障礙者；（6）免疫系統疾病者。

1.2? ? 方法? ? 全部入組者均行FQ-PCR、ELISA檢測。（1）FQ-PCR：取晨起3 mL肘靜脈血，采集血液樣本前均空腹8～10 h，將其置入真空惰性分離膠促凝管，離心處理（時間10 min，轉速3 500 r/min），制備血漿標本，之后通過熒光定量分析儀（儀器廠家：杭州安譽科技有限公司；儀器型號：AGS4800型）+熒光定量PCR診斷試劑盒（購自中山大學達安基因股份有限公司）檢測HBV-DNA。（2）ELISA：取晨起3 mL肘靜脈血，采集血液樣本前均空腹8～10 h，之后將血液樣本放置在4 ℃冰箱，時間2 h，再離心處理（時間10 min，轉速3 500 r/min，離心半徑10 cm），將上層血清置入無菌試管備測，檢測乙肝標志物時采用全自動酶免儀（儀器廠家：深圳市愛康生物科技有限公司；儀器型號：Uranus AE150型）+ELISA試劑盒（北京萬泰生物藥業股份有限公司），包括乙肝表面抗體（HBsAb）、乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗體（HBeAb）、乙肝核心抗體（HBcAb），于450 nm位置讀取酶標儀吸光度值，得到診斷結果。

1.3? ? 觀察指標? ? 記錄乙肝血清學標志物（HBsAb、HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb）結果，再將其陽性結果劃分成7種模式，其中模式1為“大三陽”（HBsAg、HBeAg、HBcAb），模式2為“小三陽”（HBsAg、HBeAb、HBcAb），其他模式分別是：模式3（HBsAg、 HBeAg）、模式4（HBsAb、HBeAb、HBcAb）、模式5（HBsAb、HBeAb）、模式6（HBsAb、HBcAb）、模式7（HBeAb、HBcAb）。FQ-PCR檢測陽性標準為HBV-DNA>1.0×102 IU/mL，ELISA檢測陽性標準為吸光度值>1[4]。

1.4? ? 統計學方法? ? 采用SPSS 23.0統計學軟件分析數據，正態分布的計量資料以x±s表示，采用t檢驗和方差分析，計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2? ? 結果

100例HBV攜帶者中“大三陽（模式1）”共24例，HBV-DNA含量平均為（8.24±1.12）copy/mL，陽性率為95.83%（23/24），均顯著高于其他6項模式（P<0.05）；100例HBV攜帶者中“小三陽（模式2）”共31例，HBV-DNA陽性率為83.87%（26/31），均顯著高于3，4，5，6，7模式（P<0.05）；而其他模式在HBV-DNA陽性率及含量方面均無明顯差異（P>0.05），見表1。

3? ? 討論

乙肝是傳染率高、起病緩慢、傳播途徑廣的病毒性肝炎疾病。相關報道指出[5]，當前我國HBV攜帶者高達9 300萬人，且HBV感染呈現世界性流行。人類因含HBV血液、體液經破損黏膜、皮膚進入機體而感染，且傳播途徑包括血制品傳播、母嬰傳播[6-7]。我國母嬰傳播概率較高，約40%～50%的HBV感染人群因母嬰傳播而罹患乙肝。90年代初我國將兒童普種乙肝疫苗作為控制乙肝流行的重要策略[8]，通過幾十年的努力，當前屬于乙肝中度流行國家。盡管如此，由于我國是人口大國，所以當前HBsAg攜帶者仍較多，使得乙肝成為重要的公共衛生問題之一。臨床強調對乙肝進行早診早治，以阻止病情惡化，降低病死率。但是由于臨床廣泛應用抗病毒藥物，使得HBV變異株數量顯著增加，明顯提高了傳統HBV血清學檢測難度[9]，導致檢測可重復性、準確性等均出現一定缺陷，尚需完善檢測方法。

當前臨床可以通過下列方法診斷HBV感染。（1）HBV基因產物：除通過免疫學方法測定HBsAg、HBeAg等，還可依據免疫組織化學技術（兼具敏感性高、功能與形態相結合、特異性好、定位準確等優勢）、肝臟組織形態學變化等測定HBV基因產物，進而明確病毒性肝炎是否由HBV感染所致。（2）影像學：如核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、計算機X線斷層掃描（computed tomography，CT）以及超聲等檢查脾臟、膽囊以及肝臟等，從而評估有無肝硬化病變、慢性乙肝發生及進展、占位性病變性質等。（3）病理學：通過肝臟穿刺活檢能夠更為準確、早期觀察肝組織細微病變，評估HBV患者肝臟狀況，從而判斷預后情況、藥物療效等。（4）HBV共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）：HBV cccDNA被徹底清除后意味著慢性乙肝患者被治愈。當前HBV cccDNA技術進展迅猛，且以選擇性FQ-PCR發展較快，其能用于評估肝細胞內HBV cccDNA水平，從而反映免疫功能對HBV的控制情況，從而指導停藥時機。不過若想檢測HBV cccDNA，尚需肝組織活檢，具有一定的創傷性，患者接受度不高，且需進一步明確檢測標準，故推廣難度較大。

本次研究表明，FQ-PCR檢測HBV有較好效果。ELISA是檢測HBV的常用方法，通過檢測血清中特異性抗原與抗體，能夠評估有無HBV感染，加之靈敏度高、價格低廉、操作簡單，所以得到臨床推廣。然而實踐中發現該方法僅能反映HBV感染免疫應答狀態，無法定量分析HBV感染程度以及含量等[10]，所以存在一定的局限性；同時檢測結果也易受到標本保存、洗板情況、加樣時有無濺出、血清分離、孵育方式等因素的影響；另外，ELISA需要使用特殊設備，加之難以評估病毒量及感染程度間關系、反應時間長，不適用于急診初篩、門診與無償獻血。

陳春妍[11]、謝玉娜[12]的研究均指出，FQ-PCR能夠有效檢測HBV。本次研究亦發現FQ-PCR檢測準確率較高。FQ-PCR兼具DNA探針雜交、PCR技術的優勢，通過實施閉管、熒光技術檢測，能夠直接探測PCR過程中熒光信號，進而定量、定性評估HBV感染程度，反映其傳染性與復制狀況，有助于醫師準確評估病情。另外，HBsAg是區分急性乙肝與健康攜帶者的重要指標，而HBeAg是評估血清有無傳染性的重要指標，若是受檢者表現為大三陽，提示HBV-DNA復制率高且傳染性強。本研究亦顯示，相比大三陽（模式1），小三陽（模式2）的陽性率較低。主要是小三陽患者HBV復制弱、傳染性低，不過仍有HBV-DNA復制，故僅憑血清學難以評定結果，尚需檢測HBV-DNA，從而監測病情，以便及時對癥處理。值得注意的是，FQ-PCR也有局限性，例如無法對病原體入侵后機體抗體如何應答作出反映，也無法測定病原體數量，所以暫時不能取代血清學標志物；不過其檢測結果敏感度高、可靠性強，便于醫師評估HBV感染狀態以及病毒DNA復制情況，能夠在早期診斷、評估乙肝傳染性，監測治療情況等方面提供參考依據，所以臨床應用價值仍較高。

綜上所述，與ELISA相比較，FQ-PCR更能定量反映HBV復制、感染狀況，有助于早期確診乙型病毒性肝炎，以及判斷傳染性質與監測病情，值得推廣。

參考文獻

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[8]? ? 張會娟.熒光定量PCR法在乙型肝炎病毒檢測中的應用價值[J].現代診斷與治療，2021，32（8）：1296-1298.

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[11]? ? 陳春妍.熒光定量PCR法與酶聯免疫吸附法在乙型肝炎病毒檢測及療效評價中的應用價值探究[J].中國現代藥物應用，2019，13（14）：31-33.

[12]? ? 謝玉娜.熒光定量聚合酶鏈式反應法與酶聯免疫吸附試驗法在乙型肝炎病毒檢測中的應用價值[J].醫療裝備，2019，32（10）：47-48.

（收稿日期：2023-01-22）