瑞香素對胃癌細胞的抑制作用及其機制

［摘要］ 目的

探討瑞香素（Dap）對胃癌細胞的抑制作用及其機制。

方法 通過MTT實驗檢測濃度為0、30、60、90、120、150 μmol/L的Dap處理胃癌AGS細胞48 h后對細胞存活率的影響。將AGS細胞分為A～E組，分別用0、30、60、90、120、150 μmol/L的Dap培養48 h，通過光鏡和結晶紫染色觀察各組細胞數量和細胞形態的變化情況。DCF染色評估Dap對A～D組AGS細胞內活性氧（ROS）水平的影響。JC-1染色評估Dap對A～D組AGS細胞內線粒體膜電位（MMP）水平的影響。采用Western blot實驗檢測A～D組AGS細胞內LC3和P62蛋白的表達水平。通過Ad-mCherry-GFP-LC3B染色檢測AGS細胞內自噬流的變化。

結果 Dap以濃度依賴性的方式顯著抑制AGS細胞的存活率（F=321.50，t=12.44～34.77，P＜0.05），處理48 h時AGS細胞的IC50約為90 μmol/L。Dap處理48 h后，隨Dap濃度的增加，A～E組AGS細胞數量逐漸減少，扭曲和皺縮形狀的AGS細胞逐漸增多。隨著Dap濃度的升高，A～D組AGS細胞內ROS水平逐漸增高。C和D組AGS細胞中JC-1綠色/紅色熒光強度比值顯著高于A組（F=10.92，t=3.09、4.96，P＜0.05）。Western blot實驗結果表明，B～D組與A組相比，細胞內LC3B/LC3A比值顯著增高（F=36.46，t=3.17～9.78，P＜0.05），P62的表達也顯著升高（F=109.90，t=12.38～16.78，P＜0.05）。Ad-mCherry-GFP-LC3B染色發現，Dap可抑制自噬小體與溶酶體的融合，導致自噬流阻斷。

結論 Dap能夠抑制胃癌細胞的增殖，其作用機制可能與誘導胃癌細胞內ROS大量產生以及阻斷自噬流有關。

［關鍵詞］ 胃腫瘤；瑞香素；自噬；活性氧；膜電位，線粒體

［中圖分類號］ R735.2

［文獻標志碼］ A

Inhibitory effect of daphnetin on gastric cancer cells and its mechanism

ZHU Chunyang， ZHAO Shufen， WANG Yan， FANG Yuanyuan， ZHANG Siyi， QI Weiwei

（Department of Oncology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To explore the inhibitory effect of daphnetin （Dap） on gastric cancer cells and its mechanism.

Methods Gastric cancer AGS cells were treated with Dap at concentrations of 0， 30， 60， 90， 120， and 150 μmol/L， and the effect on cell viability was evaluated after 48 h using the MTT assay. AGS cells were divided into groups A to E， and each group was treated with Dap at concentrations of 0， 30， 60， 90， 120， and 150 μmol/L， respectively， for 48 h. Each group was observed for changes in cell count and morphology using optical microscopy and crystal violet staining. DCF staining was used to evaluate the effect of Dap on intracellular reactive oxygen species （ROS） levels in AGS cells in groups A to D， while JC-1 staining was used to evaluate the effect of Dap on the level of mitochondrial membrane potential （MMP） in AGS cells in groups A to D. Western blot was conducted to measure the expression levels of LC3 and P62 proteins in AGS cells in groups A to D， and changes in autophagic flux in AGS cells were measured by Ad-mCherry-GFP-LC3B staining.

Results Dap significantly inhibited AGS cell viability in a concentration-dependent manner （F=321.50，t=12.44-34.77，Plt;0.05）， with an IC50 of approximately 90 μmol/L at 48 h of treatment. After 48 h of Dap treatment， the number of AGS cells in groups A to E gradually decreased， and the number of twisted and wrinkled AGS cells gradually increased with the increase in Dap concentration. Intracellular ROS in AGS cells in groups A to D also gradually increased with the increase in Dap concentration. The ratio of JC-1 green/red fluorescence intensity in AGS cells in groups C and D was significantly higher than that in group A （F=10.92，t=3.09，4.96，Plt;0.05）. Western blot revealed that groups B to D had a significant increase in the ratio of LC3B/LC3A （F=36.46，t=3.17-9.78，Plt;0.05） and in the expression of P62 （F=109.90，t=12.38-16.78，Plt;0.05） compared to group A. Ad-mCherry-GFP-LC3B staining revealed that Dap inhibited the fusion of autophagosomes with lysosomes， resulting in the blockage of autophagic flux.

Conclusion Dap can inhibit the proliferation of gastric cancer cells， and its mechanism of action may be related to inducing significant production of ROS within gastric cancer cells and blocking the autophagic flux.

［KEY WORDS］ Stomach neoplasms; Daphnetin; Autophagy; Reactive oxygen species; Membrane potential， mitochondrial

胃癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，在所有腫瘤中的發病率高居第五位［1］。目前晚期胃癌患者的治療方案仍是以化療為主，但化療常會導致患者嚴重的不良反應和耐藥性。因此，亟需尋找治療胃癌的有效新藥物。

瑞香素（Dap）是一種天然化合物，臨床上常用于血栓閉塞性脈管炎和冠心病的輔助治療［2］。近幾年研究還發現，其同時具有抗炎、抗缺氧、抗菌和抗腫瘤等多種藥理作用［3-5］，特別是其抗腫瘤作用逐漸成為目前研究的重點。研究發現，Dap可以通過調節AMPK/Akt/mTOR通路誘導卵巢癌A2780細胞內ROS水平升高，從而致細胞凋亡［6］；Dap還可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路誘導肝癌Huh7和SK-HEP-1細胞發生細胞周期阻滯以及細胞凋亡［7］；以30 mg/kg的Dap腹腔注射裸鼠皮下成瘤模型后，可顯著抑制小鼠腫瘤的生長［6］。但目前尚不清楚Dap對胃癌的發生發展是否同樣具有抑制作用。本研究使用不同濃度的Dap處理胃癌AGS細胞，檢測Dap對AGS細胞增殖、氧化還原內環境和自噬的影響，探討Dap對AGS細胞的作用及其機制，旨在為胃癌的新藥研發提供實驗數據參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCF）、BCA蛋白檢測試劑盒、Ad-mCherry-GFP-LC3B融合蛋白腺病毒購自上海碧云天生物技術有限公司，JC-1試劑盒和ECL超敏化學發光試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司，P62（ab207305）和LC3（ab192890）購買于英國Abcam公司，Dap（HY-N0281）、氯喹（HY-17589A）和雷帕霉素（HY-10219）購買于美國MedChemExpress公司。

1.2 細胞培養

人源胃癌細胞株AGS以及人正常胃黏膜細胞GES1購自中國科學院細胞研究所，分別使用相對應的細胞專用培養液（武漢普諾賽生命科技有限公司）置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2、濕度充足的培養箱中，培養至對數生長期且生長狀態良好時用于后續實驗。

1.3 MTT實驗檢測Dap對AGS和GES1細胞存活率的影響

將Dap粉末溶于二甲基亞砜（DMSO）中配成母液，分別用AGS和GES1細胞培養液配制成濃度為0、30、60、90、120、150 μmol/L的Dap培養液。將培養至對數生長期并且生長狀態良好的AGS和GES1細胞分別接種于24孔板中，培養24 h后棄去原培養液，分別加入上述不同濃度的Dap培養液500 μL，繼續培養48 h以后。棄去原培養液，加入500 μL的MTT工作液后放置于培養箱當中孵育2 h。吸出MTT工作液，加入300 μL的DMSO于搖床上震蕩3 min混勻后，酶標儀測定波長490 nm處的吸光度值，計算細胞存活率。

1.4 光鏡觀察Dap對AGS細胞數量及形態的影響

將培養至對數生長期且生長狀態良好的AGS細胞接種于24孔板中，分別加入濃度為0、30、60、90、120、150 μmol/L的Dap培養液500 μL（A～F組），培養48 h后棄去原培養液后用PBS清洗2次，于光學顯微鏡下觀察細胞密度并拍照。拍照結束后將AGS細胞用4%多聚甲醛固定20 min，每孔加入500 μL的結晶紫染色液，染色結束后在光學顯微鏡下觀察細胞的形態并拍照。

1.5 DCF染色檢測Dap對于AGS細胞內活性氧（ROS）的影響

取接種于6孔板中培養48 h的A～D組細胞，棄去原培養液后每孔加入1 mL的DCF工作液，然后轉移到培養箱內繼續孵育30 min，再用基礎培養基清洗細胞2次，于熒光顯微鏡下觀察細胞內ROS在綠色熒光通道下的染色情況并拍照。

1.6 JC-1染色檢測Dap對AGS細胞內線粒體膜電位（MMP）的影響

取接種于6孔板中培養48 h的A～D組細胞，棄去原培養液后每孔加入1 mL的JC-1染色工作液（10 μmol/L），于培養箱中孵育20 min后用基礎培養基清洗2次，使用熒光顯微鏡于相同視野下觀察線粒體在紅色和綠色熒光通道下染色情況并拍照。用Image J軟件計算綠色/紅色熒光強度比值，以綠色/紅色熒光強度比值表示MMP變化情況。

1.7 Western blot實驗檢測Dap對AGS細胞LC3和P62蛋白表達的影響

取接種于直徑10 cm細胞培養皿中培養48 h的A～D組AGS細胞，棄去原培養液以后用PBS清洗2次。加入RIPA裂解液置于冰上裂解細胞30 min，然后在4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min，收集蛋白上清液并通過BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。變性后的蛋白上清液使用聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，隨后在290 mA的條件下轉膜90 min，再用5%的脫脂牛奶封閉2 h。用Tris-緩沖鹽水和Tween20 （TBST）清洗細胞3次，加入P62抗體（1∶1 000稀釋）與LC3抗體（1∶1 000稀釋）在4 ℃搖床上孵育過夜?；厥找豢购笫褂肨BST清洗3次，加入相同種屬的二抗（1∶5 000稀釋）在室溫下孵育1.5 h。最后用ECL超敏化學發光試劑盒在凝膠成像系統上顯影。使用Image J軟件分析LC3A、LC3B、P62和GAPDH的灰度值，并計算相對表達量。實驗重復3次，結果取均值。

1.8 以Ad-mCherry-GFP-LC3B染色檢測Dap對AGS細胞內自噬流的影響

將培養至對數生長期且生長狀態良好的AGS細胞接種于激光共聚焦培養皿中，每皿約4萬個細胞，培養24 h后棄去原培養液，每皿加入新鮮的完全培養液675 μL和Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒溶液25 μL感染24 h，棄去原培養液，并使用PBS清洗細胞1次。將AGS細胞分為對照組、Dap組、氯喹組和雷帕霉素組。對照組用AGS細胞專用培養液培養48 h；Dap組、氯喹組和雷帕霉素組分別加入濃度90 μmol/L的Dap培養液、濃度15 μmol/L的氯喹和濃度5 μmol/L的雷帕霉素，培養48 h。培養結束后用PBS清洗各組細胞1次，于激光共聚焦顯微鏡下觀察LC3B在綠色和紅色熒光通道下的染色情況并拍照。

1.9 統計學分析

使用GraphPad Prism 8對數據進行統計分析。計量資料以x-±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結" 果

2.1 不同濃度Dap對細胞存活率的影響

0、30、60、90、120、150 μmol/L濃度的Dap處理AGS細胞48 h，細胞存活率分別為（107.1±8.3）%、（76.3±5.6）%、（59.2±4.7）%、（48.2±3.3）%、（31.3±2.8）%、（21.1±1.6）%，各濃度組間比較差異具有顯著性（F=321.50，P＜0.05），隨著Dap濃度的升高，AGS細胞的細胞存活率呈顯著下降趨勢（t=12.44～34.77，P＜0.05）。Dap處理AGS細胞48 h時的IC50值約為90 μmol/L。上述不同濃度的Dap處理GES1細胞48 h后，GES1細胞存活率分別為（100.1±0.9）%、（98.3±3.9）%、（93.1±1.6）%、（91.8±0.7）%、（91.8±3.7）%、（91.4±2.9）%，各濃度組的細胞存活率均在90%以上。

2.2 不同濃度Dap對AGS細胞數量及細胞形態的影響

光鏡下觀察結果顯示，隨Dap濃度的增加，A～F組AGS細胞數量逐漸減少。結晶紫染色結果顯示，A～F組AGS細胞的形態逐漸發生變化，隨著Dap濃度增加，形狀不規則、扭曲、皺縮的AGS細胞逐漸增多。見圖1。綜合上面的實驗結果，采用0、30、60及90 μmol/L濃度的Dap用于后續實驗。

2.3 不同濃度Dap對AGS細胞內ROS的影響

熒光顯微鏡觀察結果顯示，隨著Dap濃度的升高，A～D組AGS細胞內ROS水平逐漸增高，與Dap濃度呈正相關，見圖2，圖中綠色熒光為染色的ROS。

2.4 不同濃度Dap對AGS細胞MMP的影響

A～D組AGS細胞中JC-1綠色/紅色熒光強度比值分別為0.08±0.04、0.17±0.09、0.68±0.27、1.04±0.37，各組間比較差異具有顯著意義（F=10.92，P＜0.05），其中C和D組顯著高于A組（t=3.09、4.96，P＜0.05）。見圖3。

2.5 不同濃度Dap對AGS細胞內LC3和P62蛋

白表達的影響

Western blot實驗結果顯示，A～D組AGS細胞中LC3B/LC3A比值分別為0.01±0.00、0.35±0.11、0.73±0.14、1.04±0.17，各組間比較差異有顯著性（F=36.46，P＜0.05），其中B、C、D組均顯著高于A組（t=3.17～9.78，P＜0.05）；A～D組AGS細胞中P62蛋白的相對表達量分別為0.07±0.01、0.75±0.08、0.83±0.06、0.99±0.07，各組間比較差異具有顯著性（F=109.90，P＜0.05），其中B、C、D組均顯著高于A組（t=12.38～16.78，P＜0.05）。見圖4。

2.6 以Ad-mCherry-GFP-LC3B染色檢測Dap對AGS細胞內自噬流的影響

激光共聚焦顯微鏡下觀察Ad-mCherry-GFP-LC3B染色結果示，雷帕霉素組中LC3B紅綠熒光染色結果合并后為紅色熒光，氯喹組中LC3B紅綠熒光染色結果合并后黃色熒光增加而紅色熒光減少，Dap組中LC3B紅綠熒光染色結果合并后黃色熒光顯著增加而紅色熒光顯著減少。與氯喹組相比，Dap組黃色熒光更多。見圖5。

3 討" 論

胃癌是世界范圍內的常見惡性腫瘤之一。含鉑類似物的化療方案，如順鉑和奧沙利鉑，仍然是晚期胃癌患者常用的化療方案［8］。但長期使用這些藥物會致患者產生耐藥性，從而降低療效。許多研究顯示源自植物的天然化合物對腫瘤細胞具有顯著的抑制作用［9］。Dap是一種從長白瑞香中分離提取的香豆素衍生物，具有抑制肝癌、卵巢癌、腎癌等多種惡性腫瘤細胞增殖、遷移以及促進腫瘤細胞凋亡的作用［10］。但是Dap對胃癌的作用鮮有研究，本研究旨在觀察Dap是否具有抑制胃癌細胞增殖的作用，并探究其作用機制。

本研究顯示，0、30、60、90、120、150 μmol/L濃度的Dap處理胃癌AGS細胞48 h，隨著Dap濃度的升高，AGS細胞的細胞存活率呈顯著性下降的趨勢，即Dap對細胞活性的抑制程度與Dap濃度呈正相關，計算Dap處理AGS細胞48 h時的IC50約為90 μmol/L。而0～150 μmol/L濃度的Dap處理人正常胃黏膜上皮GES1細胞48 h以后，各濃度組的細胞存活率均在90%以上，提示人正常胃黏膜上皮GES1細胞在該實驗濃度范圍內安全耐受。隨后，本研究進一步觀察上述不同濃度Dap對AGS細胞數量和形態的影響，結果顯示，隨著Dap濃度的增加，AGS細胞數量逐漸減少，不規則、扭曲和皺縮形狀的AGS細胞逐漸增多。癌細胞的增殖和遷移能力與細胞形態密切相關［11］，因此本研究結果提示Dap能夠顯著抑制AGS細胞增殖和遷移。

本研究又對Dap抑制AGS細胞增殖的機制進行了探索，結果顯示，當0、30、60、90 μmol/L濃度的Dap處理AGS細胞48 h，隨著Dap濃度的升高，AGS細胞內ROS水平逐漸增高，并且與Dap濃度呈正相關，說明Dap能夠誘導胃癌細胞內產生大量的ROS。細胞內過量的ROS會對細胞產生致命的細胞毒性作用［12］。FAN等［6］的研究亦顯示，經Dap處理以后的卵巢癌A2780細胞內也產生了大量的ROS，并抑制了卵巢癌A2780細胞的增殖，與本研究結果一致。本研究JC-1染色顯示，濃度為60和90 μmol/L的Dap處理AGS細胞48 h，細胞內MMP的綠色熒光與紅色熒光比值顯著增加，說明Dap能導致AGS細胞內MMP水平下降。過量的ROS可降低MMP水平和損傷線粒體功能，從而導致癌細胞死亡［13］。研究發現銀膠菊素通過降低胰腺癌PANC-1細胞內MMP水平，誘導PANC-1細胞發生凋亡［14］。

研究發現，細胞內ROS過度產生和MMP水平下降與細胞的自噬密切相關［15］，由此推測Dap可能對細胞自噬也有影響。自噬的發生發展包含以下5個階段：隔離膜的起始誘導、隔離膜的延伸、自噬小體的成熟和運輸、自噬小體與溶酶體的融合、自噬溶酶體內容物的降解［16］，該過程被稱為自噬流。當自噬流的5個階段順利進行時，細胞內LC3B/LC3A蛋白比值增加而P62蛋白下降［17］。本研究當以0、30、60、90 μmol/L濃度的Dap處理AGS細胞48 h，

Western blot實驗結果顯示，隨著Dap濃度的升高，AGS細胞內LC3B/LC3A蛋白比值逐漸增加，且與Dap濃度呈正相關，說明Dap誘導AGS細胞內自噬小體增加。同時本研究結果還顯示，與對照組相比，以30、60、90 μmol/L濃度的Dap處理AGS細胞48 h，細胞內P62蛋白的表達也顯著增加。P62和LC3B/LC3A表達同時上調是晚期自噬流阻斷的標志［18］。WANG等［19］研究發現，重樓皂苷是通過阻斷肝癌Hep3B細胞晚期自噬流，以抑制細胞的增殖，同樣表現為P62和LC3B/LC3A蛋白表達同時上調，與本研究結果一致。

如果自噬小體與溶酶體不能正常融合，這種情況被稱為自噬流阻斷［20］。研究表明，阻斷癌細胞內自噬流可導致細胞內代謝失衡和自噬體的異常積累，最終導致細胞死亡［18］。氯喹作為公認的晚期自噬抑制劑，通過阻斷自噬小體與溶酶體的融合發揮自噬流阻斷的作用［21］。WANG等［22］研究發現，氯喹以劑量依賴性的方式顯著抑制急性骨髓性白血病MV-4-11細胞自噬晚期自噬小體與溶酶體的融合，對MV-4-11細胞的增殖具有明顯的抑制作用。雷帕霉素是一種常用的自噬誘導劑［23］。既往研究發現，雷帕霉素可誘導子宮內膜癌HEC1A細胞發生自噬［24］。本研究通過Ad-mCherry-GFP-LC3B染色檢測AGS細胞自噬流的進展情況，這種染色方法是基于溶酶體內部的低pH值淬滅了GFP的綠色熒光，而mCherry在酸性環境中表現出穩定的紅色熒光。因此，自噬小體和溶酶體順利融合時，GFP在溶酶體酸性環境中淬滅而紅色熒光穩定存在，共定位表現出紅色熒光。相反，如果自噬小體和溶酶體未能順利融合，則紅色和綠色熒光同時存在，共定位以后表現為黃色熒光。本研究采用Ad-mCherry-GFP-LC3B進行染色，結果顯示，雷帕霉素組顯示為紅色熒光，而氯喹組和Dap組表現為黃色熒光數量增加，提示Dap發揮了與氯喹相似的作用，即抑制了AGS細胞內自噬小體與溶酶體的融合，從而阻斷了自噬流。

綜上所述，Dap具有抑制胃癌增殖的能力，作用機制可能與誘導細胞內產生大量ROS和阻斷自噬晚期的自噬小體與溶酶體融合有關。本研究為Dap的臨床應用提供了實驗參考。

作者聲明：朱春陽、齊衛衛、趙淑芬參與了研究設計；朱春陽、王艷、方媛媛、張思怡參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波）