基于全基因組測序的耐多黏菌素和替加環素肺炎克雷伯菌特征研究

摘要：目的 分析1株多黏菌素和替加環素均耐藥的肺炎克雷伯菌基因組特征。方法 肺炎克雷伯菌KP2016分離自我院臨床痰液標本。采用微量肉湯稀釋法測定KP2016對亞胺培南、美羅培南、多黏菌素和替加環素的最低抑菌濃度。對菌株進行第二代Illumina和第三代Oxford Nanopore全基因組測序。通過Unicycler對第二代和第三代序列進行混合拼接。通過ABRicate v0.8.13調用Resfinder數據庫分析耐藥基因。通過ISFinder分析移動元件。利用CGE（Center for Genomic Epidemiology）網站分析菌株的ST型和質粒復制子類型。利用Proksee對質粒結構進行可視化。結果 KP2016菌株對多黏菌素和替加環素均耐藥，MIC分別為512和16 mg/L。MLST分析顯示KP2016屬于ST656，攜帶多黏菌素耐藥相關mcr-1和mcr-8基因和替加環素耐藥相關tmexCD1-toprJ1基因簇。KP2016攜帶1個染色體和5個環形質粒，質粒大小3，991～275，345 bp，GC含量44.35%～52.20%。mcr-1基因位于約44 kb的質粒p1上，上下游環境為ISKpn26-mcr-1-pap2-ISApl1；mcr-8基因位于IncR/IncN型質粒p2上，遺傳結構為ISEcl1-mcr-8-orf-ISKpn26；tmexCD1-toprJ1基因簇結構為IS26-tnfxB1-tmexC1-tmexcD1-toprJ1。此外，菌株還攜帶多黏菌素耐藥相關的染色體介導的CrrB突變（L204V、V237I）。結論 肺炎克雷伯菌KP2016多黏菌素耐藥由mcr-1、mcr-8和crrB突變介導，替加環素耐藥由tmexCD1-toprJ1基因簇介導。應加強合理監測，防止其在醫療機構中進一步傳播。

關鍵詞：肺炎克雷伯菌；全基因組測序；多黏菌素；替加環素；質粒結構

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Investigation of the characterization of polymyxin- and tigecycline-resistant Klebsiella pneumoniae based on whole genome sequencing

Zhou Yanxia1 and Guo Hui1

（1 Department of Clinical Laboratory， Jinhua People’s Hospital， Jinhua 321000）

Abstract Objective This study aimed to investigate the genomic feature of one Klebsiella pneumoniae strain that was resistant to polymyxin and tigecycline. Methods K. pneumoniae KP2016 was isolated from clinical sputum samples from our hospital. The minimum inhibitory concentrations of KP2016 against imipenem， meropenem， polymyxin and tigecycline were determined by the broth microdilution method. The second generation of Illumina and the third generation of Oxford Nanopore whole-genome sequencing were performed. Hybrid assembly of second- and third-generation sequences was performed by Unicycler. ABRicate v0.8.13 was used to analyze drug resistance genes with the Resfinder database. Mobile elements were analyzed via ISFinder. The ST type and plasmid replicon type of the strain were analyzed using the CGE （Center for Genomic Epidemiology） website. Plasmid structures were visualized using Proksee. Results The KP2016 strain was resistant to polymyxin and tigecycline， with MICs of 512 and 16 mg/L， respectively. MLST analysis showed KP2016 belonged to ST656， carrying the polymyxin resistance-related mcr-1 and mcr-8 genes and the tigecycline resistance-related tmexCD1-toprJ1 gene cluster. KP2016 carried one chromosome and five circular plasmids; the size of the plasmid was 3，991～275，345 bp， and the GC content was 44.35%～52.20%. The mcr-1 gene was located on the plasmid p1 of about 44 kb size， and the upstream and downstream environment was ISKpn26-mcr-1-pap2-ISApl1; the mcr-8 gene was located on the IncR/IncN type plasmid p2， and the genetic structure was ISEcl1-mcr-8-orf-ISKpn26; the structure of the tmexCD1-toprJ1 gene cluster was IS26-tnfxB1-tmexC1-tmexcD1-toprJ1. In addition， the strain also carried chromosomal-mediated CrrB mutations （L204V， V237I） related to polymyxin resistance. Conclusion The polymyxin resistance of KP2016 was mediated by mcr-1， mcr-8 and crrB mutations， and the tigecycline resistance was mediated by the tmexCD1-toprJ1 gene cluster. Reasonable surveillance should be strengthened to prevent its further spread in healthcare settings.

Key words Klebsiella pneumoniae; Whole-genome sequencing; Polymyxin; Tigecycline; Plasmid structure

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是最常見的機會致病菌之一。它通常會引起各種醫院獲得性感染，包括呼吸道感染、尿路感染和血流感染，這對全球臨床環境構成了新的挑戰[1]。重要的是，廣泛耐藥肺炎克雷伯菌的出現和傳播嚴重限制了抗菌藥物的有效使用，導致治療選擇受限，它的臨床治療主要依賴于最后一線抗感染藥物，如多黏菌素和替加環素[2]。然而，肺炎克雷伯菌可能會產生一系列導致對多黏菌素和替加環素耐藥的因素，包括染色體耐藥相關基因突變或獲得質粒介導的耐藥基因[3]。因此，研究對多黏菌素和替加環素耐藥的菌株基因組特征和結構具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

肺炎克雷伯菌KP2016分離自我院臨床痰液標本。大腸埃希菌ATCC25922購自美國菌種保藏中心。

1.2 儀器和試劑

儀器：二代Illumina測序儀（深圳華大基因科技有限公司）；三代Oxford測序儀（深圳華大基因科技有限公司）；-80 ℃低溫冰箱（美國Thermo Scientific）；NanoDrop 2000分光光度計（美國Nano Drop "Technologies）；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜MALDI-TOF質譜儀（法國Bio Mérieux）。

試劑：美羅培南（0.5 g，國藥準字H20093466，上海上藥新亞藥業有限公司）；亞胺培南（1.0 g，國藥準字H20084019，大連美侖生物技術有限公司）；多黏菌素（1.0 g，美國Sigma公司）；替加環素（1.0 g，美國Sigma公司）；E-test藥敏試條（法國BioMérieux公司）；MH肉湯（英國Oxoid公司）；比濁儀（法國BioMérieux公司）；Brain Heart Infusion（BHI）肉湯粉（英國Oxoid公司）；氯化鈉（上海生工生物工程有限公司）；QIAamp DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）；Gentra? Puregene? Yeast/Bact. Kit（德國Qiagen公司）；蛋白酶K（德國Qiagen公司）；SQU-LSK109 Ligation Sequencing kit（英國Oxford Nanopore Technologies公司）；EXP-NBD104免擴增條形碼擴展包（英國Oxford Nanopore Technologies公司）。

分析軟件：測序原始數據拼接和相關分析在華大公司進行。

1.3 菌株分離、鑒定和藥敏

KP2016分離自檢驗科常規臨床診斷。利用MALDI-TOF質譜儀對菌種進行鑒定，利用MALDI-TOF質譜儀對菌種進行鑒定。

1.4 微量肉湯稀釋法測定藥物敏感性

采用微量肉湯稀釋法測定KP2016對亞胺培南、美羅培南、多黏菌素和替加環素的最低抑菌濃度。將細菌接種于MH平板上過夜培養，用0.85%的生理鹽水調至1.5×108 CFU/mL左右并將菌液稀釋20倍；在無菌環境下打開96孔板，在縱向第一孔內加入200 μL含藥陽離子調節MH肉湯（CAMHB），其余孔內分別加入100 μL CAMHB，倍比稀釋至最后一孔，棄去最后孔內的100 μL液體；吸取10 μL稀釋后菌液于96孔板中，37 ℃培養箱中過夜培養。藥敏結果根據美國臨床和實驗室標準化協會CLSI 2021標準判讀。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。注意：CLSI推薦微量肉湯稀釋法為檢測多黏菌素敏感性的金標準，檢測時需要配置鈣調陽離子肉湯；進行替加環素藥敏時需在避光條件下進行。

1.5 第二代Illumina和第三代Oxford Nanopore測序

利用Qiagen二代基因組提取試劑盒提取KP2016菌株基因組DNA，NanoDrop 2000測定DNA濃度，A260/A280應大于1.8。質檢合格的DNA在Illumina HiSeq X Ten平臺進行2×150 bp讀長測序。進一步使用Gentra?Puregene?Yeast/Bact. Kit對DNA進行提取，DNA質量用NanoDrop 2000和Qubit 4.0熒光定量儀進行質檢，用SQU-LSK109連接測序試劑盒和EXP-NBD104免擴增條形碼擴展包進行文庫構建，質檢合格后，通過GridION X5進行測序。

1.6 生物信息學分析

通過Unicycler對二代和三代序列進行混合拼接。通過ABRicate v0.8.13調用Resfinder數據庫分析耐藥基因[4]，通過ISFinder分析移動元件[5]。利用CGE（Center for Genomic Epidemiology）網站分析菌株的ST型和質粒復制子類型。利用Proksee（https：//proksee.ca/projects）對質粒結構進行可視化。

2 結果

2.1 藥敏結果

KP2016菌株對多黏菌素和替加環素均耐藥，MIC分別為512和16 mg/L，而對亞胺培南和美羅培南敏感，MIC分別為1和2 mg/L。

2.2 ST型、耐藥基因和耐藥基因相關突變分析

MLST分析顯示KP2016屬于ST656（gapA-infB-mdh-pgi-phoE-rpoB-tonB：4-4-1-1-7-4-4）。耐藥基因分析顯示KP2016攜帶β-內酰胺類（blaSHV-187、blaTEM-1B和blaDHA-1）、氨基糖苷類[strAB、aph（3’ ）-Ia、aph（4）-Ia、aac（3）-IV、aadA1、aadA2和armA]、大環內酯[mph（A）、msr（E）和mph（E）]、磺胺類藥物（sul1和sul3），喹諾酮類（qnrB4）、苯酚（cmlA1）、多黏菌素（mcr-1和mcr-8）和四環素或替加環素[tet（A）、tet（M）和tmexCD1-toprJ1]。此外，檢測到賦予對氟喹諾酮類藥物耐藥性的GyrA（S83I）和ParC（S80I）突變和多黏菌素耐藥相關的CrrB突變（L204V、V237I）。

2.3 染色體和質粒攜帶情況

KP2016攜帶一個染色體和5個環形質粒，質粒大小3，991～275，345 bp，GC含量44.35%～52.20%。p1-p4攜帶不同的耐藥基因。其中，替加環素耐藥相關外排泵編碼基因tmexCD1-toprJ1位于p4質粒上，mcr-8位于p2質粒上，mcr-1位于p1質粒上（表1）。

2.4 mcr-1質粒特征

mcr-1基因位于約44 kb的質粒p1上，GC含量為44.57%，屬于IncX1型質粒。在結構上，發現mcr-1基因的上下游環境為ISKpn26-mcr-1-pap2-ISApl1（圖1A）。除了mcr-1之外，在質粒p1上還發現了四環素耐藥基因tet（M）。此外，由于存在完整的vir操縱子，質粒p1攜帶IV型分泌系統相關基因。

2.5 mcr-8質粒特征

mcr-8基因位于具有IncR/IncN型復制子的多復制子質粒p2上。mcr-8周圍區域的遺傳結構為ISEcl1-mcr-8-orf-ISKpn26（圖2），與數據庫中pMCR8_095845（CP031883）、pD120-1（CP034679）和pMCR8_020135（CP037964）的mcr-8區域結構相同。此外，質粒p2上攜帶3個拷貝的同方向的IS903B，分別位于ISEcl1-mcr-8-orf-ISKpn26遺傳結構較遠的上游和下游。

2.6 替加環素耐藥相關機制

研究發現，p4質粒上攜帶一個與替加環素耐藥相關的基因簇-tmexCD1-toprJ1。基因簇上游存在一個拷貝IS26，結構為IS26-tnfxB1-tmexC1-tmexcD1-toprJ1（圖3），其中tnfxB1-tmexCD1-toprJ1基因簇的負調控因子。IS26-tnfxB1-tmexC1-tmexcD1-toprJ1結構與其他文獻中報道的tmexCD1-toprJ1上下游結構相同，且上游的插入序列IS26可以介導tmexCD1-toprJ1基因簇的轉移。

3 討論

多黏菌素和替加環素通常在體外和體內對重癥患者具有很好的活性，尤其是產碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌[6-7]。然而，臨床上逐漸出現了對多黏菌素和替加環素耐藥的菌株，導致治療選擇受到限制。本研究中的菌株雖然對碳青霉烯類藥物敏感，若進一步通過接合獲得攜帶碳青霉烯耐藥基因（如blaKPC-2或blaNDM-1）的質粒，將導致此菌株變為對臨床上多種重要抗菌藥物耐藥的“超級細菌”，具有巨大的潛在危害。

多黏菌素耐藥性的潛在機制通常由染色體突變（mgrB、phoP/phoQ、pmrA/pmrB和crrAB）以及質粒相關的mcr-1及其變體（mcr-2至mcr-10）介導[8]。本研究存在染色體突變相關的crrAB " " " " " " " " " " " " " " " " " " " 和質粒介導的mcr-1及mcr-8共存。基于攜帶mcr-8的質粒的遺傳背景，筆者認為IS903B可能在ISEcl1-mcr-8-orf-ISKpn26區域的移動中發揮重要作用，因為2個拷貝的IS903B也位于pD120-1（Genbank號：CP034679，分離自四川豬糞便標本的Klebsiella quasipneumoniae）和pMCR8_020135（Genbank號：CP037964，分離自四川患者標本的肺炎克雷伯菌）上的mcr-8側翼區域。此外，替加環素也被認為是治療多重耐藥肺炎克雷伯菌感染的少數藥物之一。然而，隨著這種抗生素在臨床上的廣泛使用，替加環素耐藥腸桿菌目細菌越來越多。替加環素耐藥機制與核糖體（rpsJ基因）和質粒介導的移動耐藥基因[tet（X）變體、tet（A）和tet（M）基因]突變有關[9]。近年來報道了外排泵tmexCD1-toprJ1基因簇，其可導致臨床菌株對一些藥物（如：替加環素）的耐藥，與對照相比，獲得含有tmexCD1-toprJ1的質粒可導致替加環素的敏感性大大降低[10-11]。鑒于此，本研究中的菌株替加環素耐藥機制主要為攜帶tmexCD1-toprJ1基因簇。鑒于其上游存在一個拷貝的IS26，猜測此替加環素耐藥相關基因簇可能是由IS26介導插入的[10，12]。重要的是，許多研究只報道了肺炎克雷伯菌中mcr-8和tmexCD1-toprJ1的共存[13-14]，而本研究中除了攜帶上述兩種耐藥基因外，還攜帶質粒介導的mcr-1。

總之，本文報告了1株對多黏菌素和替加環素同時耐藥的菌株。多黏菌素耐藥由mcr-1、mcr-8和crrB突變介導，替加環素耐藥由tmexCD1-toprJ1基因簇介導。此類菌株的出現將導致臨床治療選擇更加受限。因此，應加強合理監測，防止此類多黏菌素和替加環素耐藥的肺炎克雷伯菌在醫療機構中進一步傳播。

參 考 文 獻

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