基于Trx2/ASK1信號通路探討補骨顆粒對軟骨細胞凋亡的調控機制

余光書　林焱斌　王松清　吳春玲

【摘 要】目的：觀察補骨顆粒對軟骨細胞凋亡及對Trx2/ASK1/Caspase-3表達的影響，從而探討補骨顆粒對軟骨細胞凋亡影響機制，為進一步研究補骨顆粒防治骨關節炎奠定實驗基礎。方法：將20只SD大鼠隨機分為空白對照組，補骨顆粒低、中、高劑量組，每組5只。適應性喂養7 d，空白對照組給予蒸餾水2 mL·kg-1灌胃，補骨顆粒低、中、高劑量組給予補骨顆粒1.54 g·kg-1、3.08 g·kg-1、6.16 g·kg-1灌胃。干預14 d后，抽取血液經離心獲得血清。通過酶聯免疫吸附試驗檢測血清中Trx2、ASK1、Caspase-3表達量，采用MTT法檢測血清干預后的細胞增殖活性，采用流式細胞儀檢測血清干預后的軟骨細胞凋亡率。結果：與空白對照組比較，補骨顆粒低、中、高劑量組Trx2、ASK1與Caspase-3含量明顯減少，差異均有統計學意義（P < 0.05）；與補骨顆粒中劑量組比較，補骨顆粒低劑量組和高劑量組Trx2與ASK1含量明顯增多，補骨顆粒低劑量組Caspase-3含量明顯增多，差異均有統計學意義（P < 0.05）。與空白對照組比較，補骨顆粒低、中、高劑量組OD值明顯升高（P < 0.05）；補骨顆粒低、中、高劑量組組間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。流式細胞儀檢測發現，不加入硝普鈉時（對照組1）軟骨細胞的凋亡率最低為4.25%，加入硝普鈉后（空白對照組1）軟骨細胞的凋亡率變為46.86%，補骨顆粒低劑量組1軟骨細胞的凋亡率（30.15%）高于補骨顆粒中劑量組1（27.77%）和高劑量組1（27.41%）。結論：補骨顆粒將會調控Trx2表達，并且不同劑量補骨顆粒將會通過Trx2-ASK1解離度調控Caspase-3活化程度而影響軟骨細胞的凋亡，這將有助于進一步認識補骨顆粒對骨關節炎防治過程。

【關鍵詞】 骨關節炎；補骨顆粒；Trx2/ASK1信號通路；軟骨細胞；細胞凋亡；大鼠

Exploring the Regulatory Mechanism of Bugu Keli（補骨顆粒）on Chondrocyte Apoptosis Based on the Trx2/ASK1 Signaling Pathway

YU Guang-shu，LIN Yan-bin，WANG Song-qing，WU Chun-ling

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Bugu Keli（補骨顆粒）on chondrocyte apoptosis and Trx2/ASK1/Caspase-3 expression，in order to explore its mechanism on chondrocyte apoptosis and lay an experimental foundation for further research on the prevention and treatment of osteoarthritis by Bugu Keli.Methods：Twenty SD rats were randomly divided into a blank control group and low，medium，and high dose groups of Bugu Keli，with 5 rats in each group.Adaptive feeding for 7 days，the blank control group was given?2 mL·kg-1 of distilled water by gavage，while the low，medium，and high dose groups were given 1.54 g·kg-1，

3.08 g·kg-1，6.16 g·kg-1 of Bugu Keli by gavage.After 14 days of intervention，blood was extracted and centrifuged to obtain serum.The expression levels of Trx2，ASK1，and Caspase-3 in serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Cell proliferation activity was detected by MTT method after serum intervention，and chondrocyte apoptosis rate was detected by flow cytometry after serum intervention.Results：Compared with the blank control group，the contents of Trx2，ASK1，and Caspase-3 in the low，medium，and high dose groups were significantly reduced，with statistical significance（P < 0.05）;compared with the medium dose group，the low dose and high dose group showed a significant increase in Trx2 and ASK1 content，while the low dose group of Bugu Granules showed a significant increase in Caspase-3 content，with statistical significance（P < 0.05）.Compared with the blank control group，the OD values of the low，medium，and high dose groups were significantly increased（P < 0.05）;there was no statistically significant difference between the low，medium，and high dose groups（P > 0.05）.Flow cytometry detection showed that the lowest apoptosis rate of chondrocytes was 4.25% in control group 1 without the addition of sodium nitroprusside.After the addition of sodium nitroprusside，the apoptosis rate of chondrocytes in blank control group 1 increased to 46.86%.The apoptosis rate of chondrocytes in the low dose group 1（30.15%）was higher than that in the medium dose group 1（27.77%）and the high dose group 1（27.41%）.Conclusion：Bugu Keli will regulate the expression of Trx2，and different doses of it will affect the apoptosis of chondrocytes by regulating the degree of Caspase-3 activation through the dissociation of?Trx2-ASK1.This will help to further understand the prevention and treatment process of Bugu Keli on osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis;Bugu Keli（補骨顆粒）;Trx2/ASK1 signaling pathway;chondrocytes;cell?apoptosis;rats

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以膝關節軟骨退行性變為主要病理特征的慢性骨關節疾病，其發生、發展是軟骨細胞、細胞外基質以及軟骨下骨三者降解和合成失衡的結果。目前研究表明，軟骨細胞凋亡是骨關節炎（osteoarthritis，OA）發病機制中的重要環節，阻止或延緩軟骨細胞凋亡是防治OA的一條有效途徑［1-2］。然而，軟骨細胞凋亡受外源性通路和內源性通路相互影響，具體作用機制復雜，但在激發軟骨細胞凋亡中的級聯反應往往相輔相成，其中經過細胞凋亡信號調節激酶途徑誘導細胞凋亡發生是目前研究的方向，尤其通過中藥對機體功能調控后所產生的有效成分調控軟骨細胞凋亡是目前研究的熱點［3］。基于既往研究發現，補骨顆粒可以通過硫氧還蛋白2/凋亡信號調節激酶1（Trx2/ASK1）信號通路抑制軟骨細胞凋亡［4-5］，擬進一步從補骨顆粒與軟骨細胞凋亡的量效關系探討補骨顆粒對軟骨細胞凋亡調控機制，這將有助于進一步認識補骨顆粒對OA防治過程。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠20只，體質量（160±20）g，由中南大學湘雅二醫院提供，實驗動物生產許可證號SCXK（湘）2019-0004，飼養溫度20～25 ℃，濕度70%左右，自由進食，自由飲水，實驗動物使用許可證號SYXK（湘）2017-0002，用于制備血清；大鼠關節軟骨細胞由武漢普諾賽生命科技有限公司提供（批號CP-R092），通過Ⅱ型膠原蛋白行免疫熒光鑒定，紅色熒光為Collagen Ⅱ陽性［5］。

1.2 實驗藥物 補骨顆粒（藥物組成：骨碎補20 g、鹿銜草12 g、淫羊藿12 g、黨參15 g、茯苓20 g、三七3 g、川牛膝9 g、當歸9 g、川芎6 g、女貞子15 g、枸杞子9 g、生地黃15 g、甘草3 g），由福州市第二醫院藥劑科加工制備，每克顆粒藥含原生藥9.8 g，使用時用蒸餾水加熱溶解成1 g·mL-1的水溶液。

1.3 實驗試劑 MTT試劑盒（Sigma公司，批號M2128）；凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號KGA1030）；Trx2試劑盒、ASK1試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號bs-4256R、bs-3029R）；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase-3）（Proteintech公司，批號ab44976）；硝普鈉（索萊寶科技有限公司，批號HY-A0119）；DMEM培養基（Sigma公司，批號D5796）；胰酶消化液（Abiowell公司，批號AWC0232）；胎牛血清（Gibco公司，批號10099141）；雙抗（青鏈霉素，碧云天生物科技有限公司，批號SV30010）；PBS（Abiowell公司，批號AWC0409）。

1.4 實驗儀器 超凈工作臺（北京亞泰隆儀器技術有限公司，型號YT-CJ-2NB）；直熱式二氧化碳培養箱（上海三騰儀器有限公司，型號DH-160I）；倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業儀器儀表有限公司，型號DSZ2000X）；低速離心機（上海知信實驗儀器技術有限公司，型號SL02）；臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號H1650R）；多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司，型號MB-530）；流式細胞儀（Beckman，型號A00-1-1102）；電熱恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器有限公司，型號DHP-500）；全自動酶標洗板機（深圳市匯松科技發展有限公司，型號PW-812）。

2 方 法

2.1 實驗分組與血清制備 將20只SD大鼠按照隨機數字表法分為空白對照組，補骨顆粒低、中、高劑量組，每組5只。適應性喂養7 d，空白對照組給予蒸餾水2 mL·kg-1灌胃，補骨顆粒低、中、高劑量組給予補骨顆粒1.54 g·kg-1、3.08 g·kg-1、

6.16 g·kg-1灌胃（中劑量組濃度依據臨床常用量按實驗動物與人體表面積折算的等效劑量比值換算［6］，低劑量組濃度為中劑量組1/2，高劑量組濃度為中劑量組2倍），每日1次，連續14 d。于最后一次灌胃后2 h腹主動脈無菌取血，常溫下靜置60 min，離心機以2000 r·min-1離心10 min，離心半徑為21 cm，后取同組血清混合，再離心1次，56 ℃滅活30 min，過濾除菌后用于進一步實驗。

2.2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清中Trx2、ASK1、Caspase-3含量 取上述4組適量血清按照ELISA檢測說明書進行檢測：將50 mL不同濃度的標準品或稀釋5倍的蛋白質樣品加入每個標準品或樣品孔中；接著加入100 μL酶標試劑，用封板膜封板后于37 ℃孵育60 min。然后，小心揭掉封板膜，棄去液體后用吸水紙拍干，每孔加入洗滌液350 μL，浸泡1 min，洗板；重復5次后，每孔加入50 μL底物A和B，37 ℃避光孵育15 min。然后，在每個孔中加入50 μL終止溶液，并根據Trx2、ASK1、Caspase-3 ELISA說明書，在450 nm處依次測量每個孔的光密度（OD）值。每組樣品平行重復5次。以標準品的濃度為橫坐標，對應的OD值為縱坐標，繪制標準品的線性回歸曲線，根據曲線方程計算各樣品的濃度值。

2.3 MTT法檢測細胞增殖活性 將大鼠軟骨細胞培養于含體積分數為10%的胎牛血清（FBS）加質量分數為1%的雙抗DMEM培養基中，置于37 ℃，體積分數為5%的CO2飽和濕度培養箱中培養。取第3代SD大鼠軟骨細胞，消化計數，以5×103個細胞/孔密度接種于96孔板內，每孔100 μL，置于37 ℃，體積分數為5%的CO2恒溫培養箱培養24 h貼壁。加入不含小牛血清的單純DMEM培養基，饑餓24 h，使細胞同步化于G0或G1期。取上述4組血清分別稀釋為體積分數為15%［3］，然后再分別進一步培養軟骨細胞，各組均設4個復孔，培養24 h后更換完全培養基100 μL，每孔加入5 mg·mL-1 MTT（每孔10 μL），37 ℃，體積分數為5%的CO2恒溫培養箱繼續孵育4 h。吸去含MTT和舊的培養基溶液，加入二甲基亞砜每孔150 μL，充分混勻，于Bio-Tek酶標儀分析490 nm處OD值，取均值并繪制生長曲線。

2.4 流式細胞儀檢測軟骨細胞凋亡率 取第3代SD大鼠軟骨細胞，消化計數，以1×105個細胞種植于24孔板，于37 ℃，體積分數為5%的CO2恒溫培養箱培養24 h貼壁后加入不含小牛血清的單純DMEM培養基，饑餓24 h，使軟骨細胞同步化于G0或G1期。然后，在培養體系中分別加入2 mol·L-1硝普鈉及體積分數為15%的血清（分組：不加硝普鈉為對照組1，加入硝普鈉及空白對照組血清為空白對照組1，加入硝普鈉及低劑量組血清為補骨顆粒低劑量組1，加入硝普鈉及中劑量組血清為補骨顆粒中劑量組1，加入硝普鈉及高劑量組血清為補骨顆粒高劑量組1）。將上述分組的軟骨細胞培養24 h，然后用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集軟骨細胞。用PBS洗滌細胞2次，離心機以2000 r·min-1離心10 min，離心半徑為21 cm，收集約3.2×105個細胞，加入500 μL的結合緩沖液懸浮細胞。然后，加入5 μL膜聯蛋白V-APC混勻后加入5 μL碘化丙啶，混勻，室溫、避光反應10 min，流式細胞儀檢測軟骨細胞凋亡，在488 nm處分析細胞凋亡。膜聯蛋白V-FITC（激發波長Ex = 488 nm，發射波長Em = 530 nm）的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI紅色熒光（流式Ex = 488 nm，Em≥ 630 nm）通過FL2檢測。

2.5 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計數資料符合正態分布以表示，多組間的成對比較（F檢驗）采用單因素方差分析，方差齊時使用LSD法，方差不齊時使用Tamhane's T2；

不符合正態分布采用秩和檢驗；采用Kruskal-Wallis方法進行多組間比較。以P < 0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 各組大鼠血清中Trx2、ASK1和Caspase-3含量比較 與空白對照組比較，補骨顆粒低、中、高劑量組Trx2、ASK1和Caspase-3含量明顯減少，差異均有統計學意義（P < 0.05）；與補骨顆粒中劑量組比較，補骨顆粒低劑量組和高劑量組Trx2、ASK1含量明顯增多，低劑量組Caspase-3含量明顯增多，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

3.2 各組大鼠軟骨細胞活性比較 與空白對照組比較，補骨顆粒低、中、高劑量組軟骨細胞OD值明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）；補骨顆粒各劑量組組間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

3.3 各組大鼠軟骨細胞凋亡率比較 對照組1軟骨細胞凋亡率最低為4.25%；空白對照組1軟骨細胞凋亡率為46.86%；補骨顆粒低劑量組1軟骨細胞凋亡率為30.15%，高于補骨顆粒中劑量組1的27.77%和高劑量組1的27.41%。見圖1。

4 討 論

軟骨細胞的大量凋亡是導致OA發展的重要因素，抑制軟骨細胞凋亡是防治OA的重要方法之一；但是，不同劑量的藥物對體內經吸收代謝后出現的新成分和產物存在一定的差異，這可能對軟骨細胞產生毒性作用或者無法起到有效作用［7］。因此，本研究在既往研究的基礎上，進一步研究補骨顆粒含藥血清對軟骨細胞及Trx2/ASK1信號通路影響的量效關系［4，8］。通過不同劑量的補骨顆粒干預大鼠獲得的血清培養軟骨細胞后發現，補骨顆粒中劑量組與補骨顆粒高劑量組的軟骨細胞活性更強且抑制軟骨細胞凋亡率更好，說明過低劑量的補骨顆粒對軟骨細胞的作用較弱，在使用補骨顆粒治療OA時需要注意足夠的劑量及合適的療程。另外，研究還發現，低劑量的補骨顆粒對Trx2/ASK1/Caspase- 3蛋白表達的影響明顯低于中劑量組及高劑量組，說明足夠劑量的補骨顆粒將促進Trx2/ASK1信號通路發揮其對軟骨細胞的影響。但是，文中未涉及足夠的陽性對照，這使實驗結果的分析存在一定的不足。

軟骨細胞的凋亡通路主要有外源性通路和內源性通路兩種，其中外源性通路主要為死亡受體介導的凋亡通路，內源性通路主要為線粒體介導的凋亡通路。既往研究發現，補骨顆粒可以通過影響線粒體的活性氧含量，從而通過Trx2/ASK1信號通路引起Caspase-3瀑布式活化和軟骨細胞凋亡［4-5］。

因此，認為補骨顆粒可以通過Trx2/ASK1信號通路調控軟骨細胞的凋亡。為了進一步研究補骨顆粒對軟骨細胞凋亡影響的有效含量，本研究采用不同劑量的補骨顆粒對大鼠血清中Trx2/ASK1/Caspase-3表達進行比較，結果發現，補骨顆粒可以抑制Trx2/ASK1/Caspase-3表達，但是補骨顆粒中劑量對Trx2和ASK1表達的抑制作用更強，而補骨顆粒中劑量與高劑量對Caspase-3的表達無明顯差異，結合補骨顆粒對軟骨細胞凋亡的影響，認為中等劑量的補骨顆粒即可通過Trx2/ASK1/Caspase-3相關蛋白的表達抑制軟骨細胞凋亡，過高劑量的補骨顆粒在一定程度上影響線粒體內Trx2/ASK1表達的活性，但這仍需要進一步的實驗研究。另外，本研究中只使用了ELISA方法檢測Trx2/ASK1/Caspase-3表達量，沒有進行Western印跡法定性觀察，這也使實驗結果存在一定的不足。

Trx2是線粒體內膜蛋白中清除活性氧簇的主要蛋白，所以Trx2在維持細胞存活、降低氧化應激以及調節線粒體細胞凋亡信號轉導過程中起重要作用［9-10］。在正常情況下，Trx2與ASK1相結合并且抑制其活性；在氧化應激情況下，ASK1將從Trx2-ASK1復合體中釋放，并且激活凋亡前因子Caspase-3而觸發凋亡通路［11］。通過研究發現，補骨顆粒能夠抑制Trx2-ASK1復合物中Trx2的解離，進而起到抑制Caspase-3所誘導的軟骨細胞凋亡，并且在中劑量與高劑量補骨顆粒干預下效果更明顯。因此，認為一定劑量補骨顆粒可通過Trx2信號通路抑制軟骨細胞凋亡。另外，今后還可以應用逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應進一步檢測Trx2/ASK1/Caspase-3基因表達情況探討補骨顆粒的作用，這將更有利于探討補骨顆粒是否通過調控線粒體影響軟骨細胞的凋亡。

OA屬中醫學“痿證”“痹證”“骨痹”范疇，其病機是本虛標實，其中肝腎虧損是致病的內在因素，風寒濕邪外襲是外在因素，經絡氣血阻滯則是痹證的主要病機，這與西醫學OA的病理變化是相通的。早期OA主要是關節內的炎癥反應，進而出現軟骨細胞凋亡、關節軟骨破壞，關節炎癥反應是標痹的微觀表現，軟骨細胞凋亡則是本痿的微觀表現，而該過程受到多種細胞因子及信號通路的調控。基于既往臨床上補骨顆粒治療OA具有良好效果［9］，進一步研究發現，補骨顆粒可通過Trx2信號通路抑制軟骨細胞凋亡，為進一步了解OA的發病機制提供思路，為尋找補腎活血方藥對OA作用靶點提供依據。

補骨顆粒由骨碎補、鹿銜草、淫羊藿、黨參、茯苓、三七、川牛膝、當歸、川芎、女貞子、枸杞子、生地黃等藥物組成。現代藥理學研究表明，骨碎補、淫羊藿、鹿銜草等補益肝腎中藥可以調控蛋白質的內穩態，促進軟骨細胞的增殖［12-13］。黨參、茯苓等補氣健脾中藥可以提高抗氧化酶的活性，增強細胞的抗氧化能力［14］。三七、當歸、川牛膝等活血藥物可以通過調控線粒體信號通路控制細胞凋亡［15-16］。所以，補骨顆粒具有促進細胞增殖與抑制細胞凋亡的功效。結合研究發現，一定劑量的補骨顆粒能夠抑制軟骨細胞凋亡，補骨顆粒將會通過Trx2表達以及Trx2-ASK1解離度調控Caspase-3活化程度而影響軟骨細胞的凋亡，這將有助于進一步認識補骨顆粒對OA的防治過程。

參考文獻

［1］ WANG BEN，SHAO ZHENXUAN，GU MINGBAO，et al.

Hydrogen sulfide protects against IL-1β-induced inflammation and mitochondrial dysfunction-related apoptosis in chondrocytes and ameliorates osteoarth-ritis［J］.J Cell Physiol，2021，236（6）：4369-4386.

［2］ 王亮，張虎林，汪小敏，等.中藥干預骨關節炎軟骨細胞自噬的研究進展［J］.風濕病與關節炎，2023，12（3）：71-75.

［3］ 謝新宇，梅陽陽，付長龍，等.烏頭湯對脂多糖誘導大鼠軟骨細胞炎癥反應的影響［J］.風濕病與關節炎，2020，9（3）：1-5，11.

［4］ 余光書，林焱斌，熊國勝，等.補骨顆粒含藥血清對大鼠軟骨細胞凋亡及Trx2信號通路的影響［J］.中國骨質疏松雜志，2019，25（6）：753-757.

［5］ YU GUANG-SHU，LIN YAN-BIN，XU HONG-BIN，et al.Effect of Bugu Granules in a drug-containing serum on chondrocyte apoptosis and the Trx2 signaling path-way［J］.Z Rheumatol，2020，79（3）：304-311.

［6］ 賁長恩.醫學科研思路方法與程序［M］.北京：人民衛生出版社，2009：162.

［7］ 張靈娜，林兵，宋洪濤.中藥血清藥理學、血清藥物化學的研究概況及展望［J］.中草藥，2015，46（17）：2662-2666.

［8］ 余光書，樂立盛，卓杰，等.補骨顆粒治療骨關節炎慢性疼痛的機制研究［J］.風濕病與關節炎，2019，8（3）：33-37.

［9］ CHEN CHAOFEI，CHEN HAIXUAN，ZHOU HUANJIAO JENNY，et al.Mechanistic role of thioredoxin 2 in heart failure［J］.Adv Exp Med Biol，2017，982（1）：265-276.

［10］ SCALCON VALERIA，BINDOLI ALBERTO，RIGOBELLO MARIA PIA，et al.Significance of the mitochondrial thioredoxin reductase in cancer cells：an update on role，targets and inhibitors［J］.Free Radic Biol Med，2018，127（1）：62-79.

［11］ YAN JD，XU J，FEI Y，et al.TrxR2 deficiencies promote chondrogenic differentiation and induce apoptosis of chondrocytes through mitochondrial reactive oxygen species［J］.Exp Cell Res，2016，344（1）：67-75.

［12］ LI FENGBO，SUN XIAOLEI，MA JIANXIONG，et al.Naringin prevents ovariectomy-induced osteoporosis and promotes osteoclasts apoptosis through the mitochondria-mediated apoptosis pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，452（3）：629-635.

［13］ PAN LIANHONG，ZHANG YONGHUI，CHEN NA，et al.Icariin regulates cellular functions and gene expression of osteoarthritis patient-derived human fibroblast-like synoviocytes［J］.Int J Mol Sci，2017，18（12）：2656-2666.

［14］ ZHENG YS，WU ZS，NI HB，et al.Codonopsis pilosula polysaccharide attenuates cecal ligation and puncture sepsis via circuiting regulatory T cells in mice［J］.Shock，2014，41（3）：250-255.

［15］ ZHOU LINGLING，ZHOU CONG，FENG ZHE，et al.

Triptolide-induced hepatotoxicity can be alleviated when combined with Panax notoginseng saponins and Catapol［J］.J Ethnopharmacol，2018，214（1）：232-239.

［16］ ZHUANG CHAO，XU NAN-WEI，GAO GONG-MING，et al.Polysaccharide from Angelica sinensis protects chondrocytes from H2O2-induced apoptosis through its antioxidant effects in vitro［J］.Int J Biol Macromol，2016，87（1）：322-328.

收稿日期：2023-07-11；修回日期：2023-08-20