基于生物信息學篩選慢性腎臟病進展中自噬關鍵基因及潛在中藥預測研究

桑田 王億平

[摘要]?目的?通過生物信息學方法篩選慢性腎臟病（chronic?kidney?disease，CKD）可能的自噬關鍵風險基因，同時預測治療CKD的潛在中藥藥物，探討致病的潛在靶點及治療藥物。方法?從基因表達總表（Gene?Expression?Omnibus，GEO）數據庫獲取CKD患者腎組織測序數據。采用生物信息學方法提取正常對照組與CKD患者組的自噬相關差異表達基因（differentially?expressed?autophagy-related?genes，DEARGs），并進行基因本體（gene?ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）通路富集分析。通過支持向量機模型（support?vector?machine，SVM）確定關鍵基因。最后，通過Connectivity?Map平臺對關鍵基因篩選可能的治療CKD的中藥。結果?共獲得67個自噬相關差異基因，GO、KEGG富集分析表明DEARGs主要與巨自噬、自噬體、泛素樣蛋白連接酶結合等相關。并從2個（ATF6、GNAI3）關鍵基因篩選得到姜黃、澤瀉、丹參、地黃、五味子等多味具有潛在療效的中藥。結論?通過生物信息學分析，明確了在CKD進展中關鍵自噬基因及潛在的治療性中藥，為CKD的臨床診治提供新思路。

[關鍵詞]?慢性腎臟病；自噬相關基因；生物信息學；關鍵基因；中藥預測

[中圖分類號]?R692.5??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.06.008

Bioinformatics-based?screening?of?key?genes?for?autophagy?in?the?progression?of?chronic?kidney?disease?and?prediction?study?of?potential?Chinese?medicine

SANG?Tian1，?WANG?Yiping2

1.The?First?Clinical?Medical?College，?Anhui?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Hefei?230038，?Anhui，?China;?2.Department?of?Nephrology，?the?First?Affiliated?Hospital?of?Anhui?University?of?Chinese?Medicine，?Hefei?230031，?Anhui，?China

[Abstract]?Objective?Screening?potential?autophagy?key?risk?genes?for?chronic?kidney?disease?（CKD）?through?bioinformatics?methods，?predicting?potential?traditional?Chinese?medicine?drugs?for?treating?CKD，?and?exploring?potential?pathogenic?targets?and?therapeutic?drugs.?Methods?In?this?study，?renal?tissue?sequencing?data?of?CKD?patients?were?obtained?from?the?Gene?Expression?Omnibus?（GEO）?database.?Bioinformatics?methods?were?used?to?extract?autophagy-related?differentially?expressed?genes?（DEARGs）?from?normal?control?and?CKD?patient?groups，?and?gene?ontology?（GO）?functional?analysis?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?（KEGG）?pathway?enrichment?analysis?were?performed.?Key?genes?were?identified?by?support?vector?machine?model?（SVM）.?Finally，?the?key?genes?were?screened?for?possible?therapeutic?Chinese?medicines?by?the?Connectivity?Map?platform.?Results?A?total?of?67?autophagy-related?differential?genes?were?obtained，?and?GO，?KEGG?enrichment?analysis?showed?that?DEARGs?were?mainly?associated?with?macroautophagy，?autophagosome，?and?ubiquitin-like?protein?ligase?binding.?And?from?2?（ATF6，?GNAI3）?key?genes?screening，?we?obtained?several?herbal?medicines?with?potential?therapeutic?effects，?such?as?turmeric，?zedoary，?salvia，?dioscorea?and?schisandra.?Conclusion?Through?bioinformatics?analysis，?key?autophagy?genes?and?potential?therapeutic?traditional?Chinese?medicine?have?been?identified?in?the?progression?of?CKD，?providing?new?ideas?for?the?clinical?diagnosis?and?treatment?of?CKD.

[Key?words]?Chronic?kidney?disease;?Autophagy-related?genes;?Bioinformatics;?Key?genes;?Herbal?prediction

慢性腎臟病（chronic?kidney?disease，CKD）是一種漸進性疾病，其特點是由于各種原因造成的腎臟結構和功能的改變[1]。全世界約有10%的成年人受到某種形式的CKD的影響，每年造成120萬人死亡和2800萬人的生命損失[2-3]。然而，CKD的致病基因和分子機制尚未完全闡明。識別與該病相關的新的關鍵風險基因對于發現潛在的治療靶點具有重要意義，有助于深入理解CKD的病理、生理過程，且對提升CKD的早期診斷和治療具有顯著意義。自噬是一種關鍵的穩態機制，可清除各種受損或不需要的細胞內成分，以在應激條件下保護腎細胞。另外，自噬缺乏會增加腎臟損傷的易感性，導致腎功能下降、線粒體受損蓄積、嚴重腎纖維化和早期腎衰竭[4-5]。據報道，雙酚A（bisphenol?A，BPA）可通過升高的自噬相關基因5（autophagy-?related?gene?5，Atg5）、自噬相關基因7（autophagy-?related?gene?7，Atg7）、微管相關蛋白1A/1B輕鏈3B（Map1lc3b/?Lc3b）和Beclin-1基因水平調節自噬過程，加劇慢性腎損傷[6]。因此，需進一步研究來明確自噬相關基因在CKD進展中的作用，挖掘潛在的治療中藥，對CKD的診斷與治療具有重要意義。

本研究旨在通過從基因表達總表（Gene?Expression?Omnibus，GEO）數據庫下載的整合基因表達譜數據來探索自噬相關基因在腎纖維化中的作用。利用支持向量機（support?vector?machine，SVM）模型確定關鍵自噬關鍵基因，對關鍵基因預測可能的治療中藥。本研究為研究CKD的分子機制和探索治療性中藥提供理論依據。

1??資料與方法

1.1??數據搜集

通過人類自噬數據庫獲得參與自噬的基因。利用GEO數據庫獲得包含8名健康對照者和54例CKD患者的腎組織樣本的GSE66494數據集，基于平臺注釋文件將數據集中的探針標識轉換為基因名，進行批次矯正后用于后續篩選差異表達基因。

1.2??差異表達分析和蛋白質-蛋白質相互作用分析

使用R包“limma”分析232個自噬相關基因在健康對照者和CKD患者之間的差異表達水平，在|log2FC|>2和校正后的P<0.05的標準下，得到不同的自噬相關差異表達基因（differentially?expressed?autophagy-related?genes，DEARGs），并利用ggplot2和pheatmap包進行可視化處理。通過使用用于檢索相互作用基因的搜索工具（STRING?11.0）研究DEARGs的功能相互作用。然后通過Cytoscape?3.9.1構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein?interaction?networks，PPI）網絡。

1.3??GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

為進一步研究自噬相關基因DEG的富集途徑和功能，將基因導入DAVID?6.8，并通過使用R中的“ggplot2”包進一步可視化富集結果。

1.4??機器學習篩選關鍵基因

利用基于e1071包的支持向量機-遞歸特征消除（support?vector?machine-recursive?feature?elimination，SVM-RFE）算法從重要DEG中篩選特征基因，同時根據關鍵基因在正常樣本和CKD患者樣本中的表達情況。利用受試者操作特征曲線（receiver?operating?characteristic?curve，ROC曲線）評估關鍵基因診斷CKD的有效性，并使用pROC包繪制關鍵基因的ROC曲線。

1.5??基于Coremine?Medical數據庫的中藥篩選

利用Coremine?Medical數據庫作為分析工具，將篩選得到的關鍵基因輸入該數據庫進行進一步分析。通過設置統計學顯著性閾值P<0.05，對基因與相應中藥之間的關聯性進行映射，以識別具有潛在治療效果的中藥。

2??結果

2.1??差異表達分析和蛋白質相互作用分析

從GEO數據庫提取232個自噬相關基因進行差異分析，得到67個DEARGs，見圖1A。然后使用STRING?11.0研究67個DEARGs的功能相互作用，通過Cytoscape?3.9.0構建PPI網絡，如圖1B。

2.2??GO生物功能富集分析與KEGG途徑富集化分析

為進一步探索67個DEARGs的富集途徑和功能，將基因導入DAVID?6.8，并使用R中的“ggplot2”包進一步可視化富集結果。這些基因主要參與大自噬、位于自噬體、主要表現為泛素?樣蛋白連接酶結合，見圖2A。KEGG分析表明139個DEARGs主要參與巨自噬、自噬調節、細胞對外部刺激的反應等，見圖2B。

2.3??SVM篩選關鍵基因

為進一步縮小自噬相關基因的范圍，使用SVM-?RFE算法對67個CKD的DEARGs進行進一步篩選，見圖3A，得到2個自噬關鍵基因ATF6、GNAI3。繪制ROC曲線對關鍵基因的診斷效能進行評估，ROC曲線顯示ATF6、GNAI3在曲線下面積（area?under?the?curve，AUC）均接近1，即篩選出的2個關鍵基因對區分CKD患者與健康對照者具有較高的診斷效能，見圖3B、圖3D。

2.4??中藥預測結果

將2個關鍵基因定位到Coremine?Medical數據庫，根據P<0.05為條件篩選治療CKD的潛在中藥，獲得姜黃、澤瀉、丹參、地黃、五味子等多味中藥，見表1。

3??討論

各種慢性進展性腎病的最終表現均為腎纖維化，腎纖維化是導致CKD發展到終末期腎臟疾病（end-stage?kidney?disease，ESRD）的主要病理基礎，而自噬在纖維化相關的CKD的進展中起關鍵作用[7]。因此，探索和發現自噬參與腎纖維化的潛在機制對于發現CKD的潛在治療靶點極為重要。

本研究獲得67個差異表達的自噬相關基因，并用于GO功能和KEGG通路分析，綜合DEARGs的富集結果發現自噬相關基因主要與巨自噬密切相關。在應激條件下，巨自噬作為一種生存機制發揮重要作用，主要負責大分子、細胞膜和細胞器的更新，維持細胞內環境的穩態[8]。這一過程通過循環利用受損和有毒的細胞組分，轉化為細胞的構建模塊，從而支持細胞抵御應激反應并維持能量平衡[9]。此外，巨噬細胞在調控炎癥反應和纖維化過程中扮演著關鍵角色[10]。因此，自噬相關基因可能在腎纖維化的進程中起重要作用。

SVM模型的進一步構建鑒定出2個自噬關鍵基因ATF6和GNAI3。ATF6（激活轉錄因子6）是一種重要的傳感器，當內質網應激誘導未折疊蛋白反應時被激活。研究發現miR-185-5p可通過下調ATF6改善內質網應激相關蛋白的表達并抑制上皮去分化，進而改善腎纖維化[11]。其亞型ATF6α下調過氧化物酶體增殖物激活受體α促進脂毒性誘導的腎小管間質纖維化[12]。因此ATF6可能成為防治CKD的有效靶點。GNAI3（G蛋白亞基αI3）是一種蛋白質編碼基因。與GNAI3相關的疾病包括耳髁綜合征1和耳髁綜合征[13-14]。有研究表明GNAI3可作為胰腺癌預后的獨立預測因子和治療非酒精性脂肪性肝病的潛在新靶點，還被鑒定為川崎病和結腸炎相關腫瘤的關鍵調控基因[15-18]。然而，GNAI3在CKD中的作用尚未報道，需要對該基因進行進一步研究。同時，本研究繪制數據集的ATF6、GNAI3的ROC曲線結果顯示，ATF6和GNAI3的ROC?AUC接近1，表明這2個標志物在區分CKD患者和非患者方面顯示出高度的診斷效能。但由于樣本量的限制，關鍵基因的診斷價值可能需要進一步檢驗。

近年來中醫藥在CKD防治中受到了更多的關注，在CKD的發展至ESRD的過程中，中醫藥在緩解臨床表現、減緩疾病進展速度及延后腎臟替代療法啟動時間等方面展現出顯著的療效優勢。本文以自噬關鍵基因篩選治療CKD的潛在中藥，得到丹參、澤瀉、地黃、姜黃和五味子等多味中藥。研究發現姜黃中的姜黃素具有抗炎、抗氧化應激、抗腫瘤等作用，并可通過腺苷酸激活蛋白激酶信號通路促進自噬從而減輕大鼠糖尿病腎病的腎臟纖維化[19]。地黃的主要活性成分地黃多糖通過緩解CKD大鼠冠脈鈣化，抑制冠脈血管平滑肌細胞中TRPC1/6蛋白的表達并促進自噬[20]。在單側輸尿管梗阻誘導的大鼠腎臟病理模型中，丹參的主要活性成分丹酚酸B通過調節自噬相關蛋白的表達來發揮作用。具體而言，丹酚酸B可通過上調LC3-Ⅱ和Beclin1的表達，同時下調哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian?target?of?rapamycin，mTOR）的表達，從而激活自噬過程，并對抗腎間質纖維化的發展[21]。另外，澤瀉在此模型中展現出對腎小管上皮細胞間充質轉分化的顯著抑制作用，減輕腎間質纖維化，并觀察到腎小管上皮細胞中C3蛋白表達的下調，這表明澤瀉可能通過影響C3途徑來抑制間充質轉分化的過程[22]。五味子中的有效成分五味子乙素可能通過調節自噬相關蛋白LC3對缺氧/復氧腎小管上皮細胞的凋亡有一定的保護作用[23]。木通中的有效成分馬兜鈴酸在低劑量引起的腎損傷過程中可能發生自噬，且自噬減輕腎臟損傷；馬兜鈴酸高劑量引起的腎損傷過程中可能發生過度自噬，且自噬加重腎臟損傷，其作用機制可能與調節p53蛋白表達相關[24]。

總之，本研究通過生物信息學的方法，為CKD與自噬之間聯系的進一步研究提供新的見解和潛在靶點。篩選的關鍵基因及中藥可為后續深入理解CKD的分子機制和開發治療藥物奠定理論基礎。本研究存在一定的不足，如關鍵基因ATF6、GNAI3的表達水平，可能需要進一步的定量聚合酶鏈式反應和免疫印跡或免疫組織化學驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–04–14）

（修回日期：2024–01–31）