Wnt/β－catenin信號通路在七氟醚誘導術后認知障礙中的作用機制

常鑫　楊文曲　韓沖芳　趙雪麗　陳焱

摘要 目的：探討通過激活Wnt/β－catenin信號通路抑制炎癥反應對七氟醚誘導的老年大鼠術后認知障礙（POCD）的影響。方法：將60只雄性大鼠隨機分為對照組（C組）、3%七氟醚組（S組）、氯化鋰（LiCl）＋3%七氟醚組（LiCl＋S組），每組20只。S組、LiCl＋S組吸入3%七氟醚6 h，C組吸入空氧混合氣體6 h，LiCl＋S組于吸入七氟醚前連續5 d腹腔注射LiCl 2 mmol/kg，每日1次。七氟醚麻醉結束后24 h，隨機取每組10只大鼠，采用Morris水迷宮實驗檢測老年大鼠認知功能，前4 d進行定位航行實驗，第5天進行空間探索實驗。水迷宮實驗結束后立即處死大鼠，采用蘇木精－伊紅（HE）染色法觀察海馬組織病理形態學改變。七氟醚麻醉結束后24 h，取每組剩余10只大鼠立即處死，采用蛋白免疫印跡法（Western Blot）法檢測海馬區腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細胞介素－1（IL－1）、β－catenin及磷酸化糖原合酶激酶 3β（p－GSK－3β）蛋白表達水平。結果：與C組相比，S組和LiCl＋S組水迷宮實驗第2天、第3天、第4天逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），第5天平臺所在象限停留時間明顯縮短（P＜0.05），穿越平臺次數明顯減少（P＜0.05），海馬組織出現病理形態學損傷，海馬區TNF－α及IL－1蛋白表達水平升高（P＜0.05），S組海馬區β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達水平降低（P＜0.05），LiCl＋S組海馬區β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與S組相比，LiCl＋S組水迷宮第2天、第3天、第4天的逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），第5天平臺所在象限停留時間明顯延長（P＜0.05），穿越平臺次數明顯增多（P＜0.05），海馬組織病理形態學損傷現象有所改善，海馬區TNF－α及IL－1蛋白表達水平明顯下降（P＜0.05），β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達水平升高（P＜0.05）。結論：LiCl通過激活Wnt/β－catenin信號通路抑制炎癥反應改善七氟醚誘導的術后認知障礙。

關鍵詞 認知障礙；Wnt/β－catenin信號通路；七氟醚；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.013

術后認知障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是一種多發于老年人的術后并發癥，表現為認知能力下降、精神錯亂和人格改變等，其發生影響病人的健康，給病人家庭和社會造成了極大的負擔。因此，預防POCD的發生以及促進認知功能的恢復具有重要意義［1］。七氟醚是臨床上廣泛應用的吸入麻醉藥，研究表明，七氟醚可以誘導老年大鼠發生認知功能損傷，并且與激活的炎癥反應有關［2］。Wnt信號通路參與對海馬記憶功能的調控，包括Wnt3a、糖原合酶激酶 3β（GSK－3β）、β－catenin等，其中GSK－3β是該信號通路的負調節劑，氯化鋰（LiCl）是該通路的激活劑［3］。研究證實，Wnt/β－catenin信號通路通過抑制核轉錄因子κB（NF－κB）通路減少炎性因子的轉錄，起到抗炎的作用［4］。另外，七氟醚在誘導術后認知障礙過程中表現出與神經系統退行性疾病阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）相似的病理改變，而在AD中，LiCl通過激活Wnt/β－catenin信號通路可以減輕炎癥反應和海馬神經元的損傷，起到神經保護的作用［5］。但在七氟醚誘導的POCD中，LiCl是否通過激活Wnt信號通路調控炎癥反應發揮作用尚無相關報道。本研究擬探討LiCl通過激活Wnt信號通路調控炎癥反應在七氟醚誘導POCD中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

60只300～350 g雄性SD大鼠（鼠齡19～22個月）由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供。實驗前在暗室［溫度（23±3）℃，相對濕度40%～70%］分籠飼養1周，并給予充足的水與食物。實驗前禁食12 h，自由飲水。將大鼠隨機分為對照組（C組）、3%七氟醚組（S組）、LiCl＋3%七氟醚組（LiCl＋S組），每組20只。參考相關文獻［6］的方法，S組、LiCl＋S組吸入3%七氟醚6 h，C組吸入空氧混合氣體6 h。LiCl＋S組于吸入七氟醚前連續5 d腹腔注射LiCl（120M0215V，Sigma公司）2 mmol/kg，每日1次。

1.2 Morris水迷宮實驗

每組隨機取10只大鼠在麻醉結束后24 h行Morris水迷宮實驗，前4 d進行定位航行實驗，第5天進行空間探索實驗。前4 d將大鼠依次從不同象限面向池壁放入水中，記錄大鼠從入水到爬上平臺所需的時間，即逃避潛伏期，停留30 s后進行下一象限的實驗。將60 s內未找到平臺的逃避潛伏期記為60 s，由實驗者將其引上平臺并停留30 s。第5天進行空間探索實驗，將水中平臺撤除，并將大鼠從任一象限放入水中。記錄其在60 s內的游泳速度、穿越平臺次數和平臺所在象限停留時間。

1.3 蘇木精－伊紅（HE）染色

水迷宮實驗結束后，在冰上取出大鼠腦組織，經生理鹽水沖洗后在4%多聚甲醛中固定，然后進行脫水，石蠟包埋，切片。將石蠟切片進行HE染色，中性樹脂封片，然后在顯微鏡下觀察。

1.4 蛋白免疫印跡法（Western? Blot）檢測

每組取剩余10只大鼠在麻醉后的24 h立即處死，取出海馬組織，提取目標蛋白，采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）方法，將準備好的樣品液和預染蛋白Marker分別上樣，電泳分離蛋白。轉膜結束后在5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h。加入腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細胞介素－1（IL－1）、β－catenin、磷酸化GSK－3β（p－GSK－3β）及甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（1∶1 000，武漢愛博泰克生物科技有限公司）4 ℃過夜，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000，武漢愛博泰克生物科技有限公司），室溫孵育1 h。化學發光法對條帶顯影后，采用Image J軟件檢測海馬區TNF－α、IL－1、β－catenin及p－GSK－3β蛋白相對表達水平。

1.5 統計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間差異的采用LSD法進行兩兩比較，重復測量資料采用重復測量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠認知功能比較

3組大鼠水迷宮實驗第1天逃避潛伏期比較差異無統計學意義（P＞0.05），第2天、第3天、第4天逃避潛伏期逐漸縮短。與C組比較，S組和LiCl＋S組水迷宮實驗第2天、第3天、第4天逃避潛伏期明顯延長，第5天平臺所在象限停留時間明顯縮短，穿越平臺次數明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與S組比較，LiCl＋S組水迷宮實驗第2天、第3天、第4天的逃避潛伏期明顯縮短，第5天平臺所在象限停留時間明顯延長，穿越平臺次數明顯增多，差異均有統計學意義（P＜0.05）。3組大鼠水迷宮實驗期間游泳速度比較差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1、表2。

2.2 3組大鼠海馬組織病理形態學比較

C組大鼠海馬組織神經元細胞形態正常，細胞排列整齊規則。與C組比較，S組海馬組織神經元細胞分布不均勻，排列紊亂，出現大量核固縮。與S組比較，LiCl＋S組海馬組織神經元細胞排列紊亂現象有所改善，出現核固縮的細胞減少。詳見圖1。

2.3 3組大鼠海馬區TNF－α、IL－1、β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達水平比較

與C組比較，S組海馬區TNF－α及IL－1蛋白表達水平升高（P＜0.05），β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達水平降低（P＜0.05）；LiCl＋S組海馬區TNF－α及IL－1蛋白表達水平升高（P＜0.05），β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與S組比較，LiCl＋S組海馬區TNF－α及IL－1蛋白表達水平降低（P＜0.05），β－catenin及p－GSK－3β蛋白表達水平升高（P＜0.05）。詳見表3、圖2。

3 討 論

七氟醚可以誘導POCD的發生，導致空間學習能力和記憶能力的下降［7］。以往研究表明，當吸入高于3%濃度的七氟醚6 h后，老年大鼠認知功能發生明顯損傷［8］。因此，本實驗選擇吸入3%七氟醚6 h。與C組相比，S組大鼠在七氟醚麻醉后的逃避潛伏期明顯延長，平臺所在象限停留時間明顯縮短，穿越平臺次數明顯減少。說明七氟醚麻醉后大鼠出現了認知能力的下降，模型制作成功。

麻醉后機體釋放的大量細胞信號分子結合相應受體而觸發炎癥反應，包括TNF－α、IL－1、IL－6等［9］。海馬區TNF－α、IL－6等炎性因子的異常表達介導細胞凋亡，參與POCD的發生［10］。七氟醚通過促進炎癥反應以及神經細胞的凋亡導致POCD的發生［11］。臨床研究發現，吸入七氟醚超過3 h可以促進POCD的發生，并且與血清TNF－α的表達水平有關［12］。動物實驗發現，在七氟醚誘導的老年大鼠POCD模型中，海馬組織神經細胞發生了明顯損傷［8］。本研究結果顯示，老年大鼠吸入3%七氟醚6 h后認知能力下降，海馬區中TNF－α及IL－1表達水平明顯升高，同時光學顯微鏡下海馬組織神經元細胞分布不均勻，排列紊亂。證實了七氟醚誘導的POCD與激活的炎癥反應有關，與以往的研究結果相符。

Wnt/β－catenin通路的激活可抑制炎癥反應的發生，一方面，Wnt共受體LRP5包含一種抗炎巨噬細胞表型，可以減少單核細胞向巨噬細胞分化［13］；另一方面，Wnt/β－catenin通過磷酸化GSK－3β抑制核因子－κB（NF－κB）信號通路，從而減少促炎基因的轉錄［14］。研究證實，Wnt/β－catenin通路參與了POCD的發生［15］，在內皮細胞中，吸入3%七氟醚6 h可以抑制Wnt/β－catenin通路，從而下調Annexin A1的表達，引起血腦屏障的損傷，導致POCD的發生［16］。轉基因小鼠中，DKK－1的過表達可通過抑制Wnt/β－catenin通路，引起Tau蛋白過度磷酸化和認知功能障礙［17］。在本研究中，LiCl＋S組大鼠吸入3%七氟醚6 h后，海馬區β－catenin及p－GSK－3β表達水平下降，TNF－α及IL－1表達水平升高，同時海馬形態學結構發生損傷。提示七氟醚麻醉后海馬區GSK－3β活性升高，抑制Wnt/β－catenin信號通路活性，從而炎癥反應被激活。LiCl是Wnt/β－catenin通路的激活劑，可以調節GSK－3β的活性［18］，給予LiCl干預后，與S組比較，老年大鼠海馬區β－catenin及p－GSK－3β表達水平升高，TNF－α及IL－1表達水平明顯下降，同時海馬形態學結構損傷減輕，學習和記憶能力有所改善。表明Wnt/β－catenin通路參與了七氟醚誘導POCD的發生，LiCl通過激活Wnt/β－catenin通路，減少炎性因子的表達和減輕海馬組織的損傷，改善老年大鼠的術后認知功能。

綜上所述，七氟醚通過抑制Wnt/β－catenin通路，激活炎癥反應，導致海馬組織損傷和POCD的發生。外源性Wnt/β－catenin激活劑LiCl可以明顯上調Wnt/β－catenin通路，抑制炎癥反應，減輕海馬組織病理形態學損傷，改善認知功能。

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（收稿日期：2022－01－08）

（本文編輯郭懷印）

通訊作者 韓沖芳，E－mail：hanchongfang2003@foxmail.com

引用信息 常鑫，楊文曲，韓沖芳，等.Wnt/β－catenin信號通路在七氟醚誘導術后認知障礙中的作用機制［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（1）：75－78.