核糖體調控因子1對人乳腺癌MDA-MB-468細胞增殖和轉移能力的影響

王潤澤　彭翠修　宋軍瑩　侯琳

［摘要］目的探討核糖體合成調控因子1（RRS1）對人乳腺癌細胞增殖和轉移能力的影響。方法通過Western Blot實驗檢測人乳腺癌細胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7細胞）以及正常人乳腺上皮細胞中RRS1蛋白的表達量；將MDA-MB-468細胞分別感染sh-RRS1慢病毒（sh-RRS1組）和陰性對照慢病毒（Con組），未進行任何感染的MDA-MB-468細胞為Blank組，在熒光顯微鏡下觀察Con組和sh-RRS1組慢病毒感染效率，采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術和Western Blot實驗分別檢測各組細胞中RRS1 mRNA和蛋白的表達水平；采用CCK-8實驗檢測RRS1對MDA-MB-468細胞活力的影響；采用劃痕實驗、Transwell實驗以及侵襲實驗檢測RRS1對MDA-MB-468細胞侵襲和遷移能力的影響。結果各乳腺癌細胞系中RRS1的表達水平均明顯高于正常人乳腺上皮細胞（F=28.71，P<0.05）；相較于Blank組和Con組，sh-RRS1組細胞中RRS1 mRNA和蛋白的表達水平均顯著降低（F=118.10、335.40，P<0.05），細胞增殖活力明顯減弱（F=825.60～2 839.00，P<0.05），侵襲和遷移能力明顯降低（F=25.60～430.80，P<0.05）。結論RRS1基因可能參與了乳腺癌細胞的增殖和轉移過程，其作用可能與細胞中RRS1的高表達有關。

［關鍵詞］乳腺腫瘤；細胞系，腫瘤；核蛋白質類；核糖體調控因子1；細胞增殖；細胞運動

［中圖分類號］R737.9［文獻標志碼］A

Effect of regulator of ribosome synthesis 1 on proliferation and metastasis abilities of human breast cancer MDA-MB-468 cellsWANG Runze， PENG Cuixiu， SONG Junying， HOU Lin（Department of Biochemistry and Molecular Biology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of regulator of ribosome synthesis 1 （RRS1） on the proliferation and metastasis abilities of human breast cancer cells.MethodsWestern Blot was used to measure the protein expression level of RRS1 in human breast cancer cell lines （MDA-MB-231， MDA-MB-468， BT549， and MCF-7） and normal human breast epithelial cells. MDA-MB-468 cells were infected with sh-RRS1 lentivirus （sh-RRS1 group） and negative-control lentivirus （Con group）， and MDA-MB-468 cells without infection were established as Blank group. Lentiviral infection efficiency was observed under a fluorescence microscope for the Con group and the sh-RRS1 group， and quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of RRS1 in cells; CCK-8 assay was used to observe the effect of RRS1 on the viability of MDA-MB-468 cells; scratch assay， Transwell assay， and invasion assay were used to observe the effect of RRS1 on the invasion and migration abilities of MDA-MB-468 cells. ResultsThe expression level of RRS1 in the breast cancer cell lines was significantly higher than that in normal human breast epithelial cells （F=28.71，P<0.05）. Compared with the Blank group and the Con group， the sh-RRS1 group had significant reductions in the mRNA and protein expression levels of RRS1 （F=118.10，335.40，P<0.05）， cell proliferation activity （F=825.60-2839.00，P<0.05）， and the invasion and migration abilities of cells （F=25.60-430.80，P<0.05）. ConclusionThe RRS1 gene might be involved in the proliferation and metastasis of breast cancer cells， which may be associated with the high expression of RRS1 in cells.

［KEY WORDS］Breast Neoplasms; Cell line， tumor; Nuclear proteins; Regulator of ribosome synthesis 1; Cell proliferation; Cell movement

乳腺癌是全球女性最高發的癌癥之一，幾十年來發病率一直持續增高[1]，約90%的乳腺癌相關死亡與其轉移有關[2]。目前，手術治療并輔以放化療是乳腺癌的主要治療方法，但治療后復發率仍然較高，且化療的副作用較大，因此尋找新的治療方法就顯得尤為重要。近年來，隨著對乳腺癌認識的不斷深入，乳腺癌的靶向治療逐漸成為研究的焦點。

乳腺癌具有增殖迅速、周圍組織浸潤和遠處擴散能力強等特點。在腫瘤發生發展過程中，腫瘤細胞有著更為活躍的核糖體生物合成功能。核糖體合成調控因子1（RRS1）作為影響核糖體合成的關鍵因子，能夠介導25S rRNA的成熟和60S亞基的組裝[3-7]，參與核糖體的生物合成。此外，RRS1在其他生理與病理過程中也發揮著重要作用。國內外研究發現，RRS1可影響細胞周期致染色體畸變[8]，可參與亨廷頓病內質網應激反應[9]，可調節細胞內的P53活性[10]，并在乳腺癌、肝細胞癌、甲狀腺乳頭狀癌、結直腸癌以及胃癌等多種腫瘤細胞中呈現高表達[11-17]。因此，RRS1有望成為乳腺癌治療的潛在新靶點，而RRS1與乳腺癌細胞系MDA-MB-468增殖和轉移的關系目前尚未見相關報道。本研究通過觀察敲降RRS1基因后乳腺癌MDA-MB-468細胞增殖、侵襲以及遷移能力的變化，探討RRS1在MDA-MB-468細胞增殖和轉移中的作用機制，為臨床治療乳腺癌提供新的思路和依據。

1材料與方法

1.1材料來源

人乳腺癌細胞系的MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7細胞以及正常人乳腺上皮細胞（HMEC）（武漢普諾賽公司），RRS1敲降慢病毒（sh-RRS1）、陰性對照慢病毒、病毒感染試劑（上海吉凱公司），Transwell小室（美國Millipore公司），細胞總蛋白提取試劑（RIPA）（思科捷公司），逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒（中國諾唯贊公司）。

1.2研究方法

1.2.1細胞的培養以及處理將人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7細胞及正常HMEC分別置于含體積分數0.10胎牛血清以及體積分數0.01青鏈霉素混合溶液的DMEM中，在含體積分數0.05 CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養，細胞密度達到80%～90%時傳代。培養至對數生長期用于后續實驗。

1.2.2慢病毒感染將培養至對數生長期MDA-MB-468細胞置于6孔板中培養，待細胞融合約至70%時，分別感染sh-RRS1慢病毒（sh-RRS1組）和攜帶無義序列的陰性對照慢病毒（Con組），Blank組MDA-MB-468細胞未進行任何感染。感染后于上述條件下繼續培養24 h，在熒光顯微鏡下觀察細胞的感染效率，48 h后進行后續實驗。

1.2.3CCK-8實驗檢測細胞活力取各組處于對數生長期的MDA-MB-468細胞，按每孔2 000個細胞接種于96孔細胞培養板中，每組設5個復孔，共接種5個96孔細胞培養板。置于培養箱中正常培養，6 h后任取一個培養板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，隨后放入培養箱中繼續孵育2 h以后，將培養板從培養箱中取出，以酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度值，吸光度值大小代表細胞活力。從接種后第2天開始，每天于相同時間點檢測，連續檢測5 d。

1.2.4Western Blot實驗檢測細胞中RRS1蛋白表達水平收取培養至對數生長期的人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7細胞、正常HMEC和各組MDA-MB-468細胞，RIPA法裂解細胞并提取細胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，加入適量5×蛋白上樣緩沖液，然后煮沸10 min。將總蛋白在100 g/L聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，將電泳后的蛋白轉至PVDF膜上，在體積分數為0.05的脫脂奶粉中封閉2 h。兔抗人RRS1抗體（1∶1 000）4 ℃下孵育過夜，以GAPDH作為內參照，羊抗兔二抗室溫下孵育1 h，顯影后拍照。蛋白條帶使用Image J軟件分析灰度值，以目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，結果取均值。

1.2.5RT-qPCR檢測細胞中RRS1 mRNA表達水平收取培養至對數生長期的各組MDA-MB-468細胞，Trizol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行RT-qPCR。嚴格按照試劑盒說明書配制反應體系，以GAPDH作為內參照，每組設3個復孔，實驗重復3次。反應條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共45個循環。采用2－△△CT方法計算各組細胞中RRS1以及GAPDH mRNA的相對表達水平。引物序列為RRS1：正向5′-CCCT-ACCGGACACCAGAGTAA-3′，反向5′-CCGAAA-AGGGGTTGAAACTTCC-3′；GAPDH：正向5′-A-GAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反向5′-AGG-GGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.2.6劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞的遷移能力劃痕實驗：取處于對數生長期的各組MDA-MB-468細胞，接種于6孔板中，當細胞密度達到80%～90%時，使用200 μL移液器槍尖垂直于孔板畫線，隨后用PBS洗滌2～3次。在孔內加入2 mL無血清培養基，并繼續培養0、6、12、24 h后，顯微鏡下觀察并拍照，記錄劃痕愈合情況，以24 h劃痕愈合情況進行遷移能力差異分析。實驗重復3次，取均值。Transwell實驗：取對數生長期的各組MDA-MB-468細胞，以1×105個細胞/孔接種于Transwell小室中的上室中，下室中加入600 μL含體積分數0.3 FBS的DMEM培養液。Transwell小室提前在上室中加入100 μL無血清培養液，并置于37 ℃培養箱中孵育1 h。加入細胞后繼續培養10～12 h，將上室中未穿過的細胞擦去，用結晶紫染液將下室的細胞染色5 min，以PBS清洗3次以后置于顯微鏡下觀察并計數細胞數目。實驗重復3次，結果取均值。

1.2.7侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力將Matrigel基質膠與無血清培養基以1∶8的比例混合，每個小室的上室中加入35 μL混合后的基質膠，并放入培養箱中孵育1 h使其聚合成凝膠，其余流程的操作同Transwell實驗。

1.3統計學分析

采用Graphpad Prism 6.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組不同時間的比較采用重復測量設計的方差分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1正常HMEC與乳腺癌細胞系中RRS1蛋白的表達量

Western Blot實驗檢測結果顯示，正常HMEC、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549以及MCF-7細胞中RRS1蛋白的相對表達量分別為0.63±0.02、1.00±0.07、1.17±0.08、1.06±0.09、1.17±0.09，各組間比較差異具有顯著性（F=28.71，P<0.05），其中人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7細胞中RRS1蛋白表達量均顯著高于正常HMEC（P<0.05），人乳腺癌細胞系各細胞間比較差異無顯著性（P＞0.05）。見圖1。

2.2RRS1對MDA-MB-468細胞增殖活力的影響

重復測量設計的方差分析結果顯示，時間、分組和時間與分組的交互作用對細胞的增殖能力均具有明顯影響（F時間=3 153.00，F組別=1 298.00，F交互=244.30，P<0.05）；與第1天相比，Blank組、Con組、sh-RRS1組其他時間點細胞增殖能力均明顯增強（F=136.70～4240.00，P<0.05）；但是與Blank組相比，sh-RRS1組細胞第2～5天的增殖能力均明顯降低（F=825.60～2 839.00，P<0.05），而Blank組與Con組細胞增殖能力比較均無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

2.3各組細胞中RRS1蛋白和mRNA表達水平的比較

MDA-MB-468細胞慢病毒感染24 h后，熒光顯微鏡下觀察并計數含有綠色熒光蛋白（GFP）的細胞，結果顯示Con組和sh-RRS1組細胞的感染效率均在80%以上。Western Blot實驗檢測結果顯示，Blank組、Con組、sh-RRS1組細胞RRS1蛋白的相對表達量分別為1.16±0.02、0.97±0.02、0.79±0.01，各組間比較差異具有顯著性（F=335.40，P<0.05），其中Blank組和Con組均顯著高于sh-RRS1組（P<0.05），Blank組和Con組間比較差異無顯著性（P＞0.05）。見圖2。RT-qPCR實驗檢測結果顯示，Blank組、Con組、sh-RRS1組細胞RRS1 mRNA的表達量分別為1.03±0.06、1.08±0.10、0.28±0.02，各組間比較差異具有顯著性（F=118.10，P<0.05），其中Blank組和Con組均顯著高于sh-RRS1組（P<0.05），Blank組和Con組間比較差異無顯著性（P＞0.05）。

2.4RRS1對MDA-MB-468細胞遷移能力的影響

劃痕實驗檢測結果表明，Blank組、Con組、sh-RRS1組細胞24 h遷移率分別為0.51±0.01、0.51±0.01、0.19±0.02，各組細胞遷移率比較差異具有顯著性（F=328.40，P<0.05），其中Blank組和Con組細胞遷移率均顯著高于sh-RRS1組（P<0.05），Blank組和Con組間比較差異無顯著性（P＞0.05）。見圖3。MDA-MB-468細胞慢病毒感染48 h以后，Transwell實驗檢測結果顯示，Blank組、Con組、sh-RRS1組細胞從小室上層穿過至下層的數目分別為428.70±28.68、423.70±11.72、49.00±5.57，各組細胞從小室上層穿至下層小室的數目比較差異具有顯著性（F=430.80，P<0.05），其中Blank組和Con組穿至下層小室的數目顯著高于sh-RRS1組（P<0.05），Blank組和Con組間比較差異無顯著性（P＞0.05）。見圖4。

2.5RRS1對MDA-MB-468細胞侵襲能力的影響

MDA-MB-468細胞感染慢病毒48 h后，侵襲實驗檢測結果顯示，Blank組、Con組、sh-RRS1組從小室上層穿過至下層的細胞數目分別為226.00±55.65、212.00±40.84、16.00±9.00，各組間比較差異具有顯著意義（F=25.60，P<0.05），其中Blank組和Con組的細胞數目均顯著高于sh-RRS1組（P<0.05），Blank組和Con組間比較差異無顯著性（P＞0.05）。見圖5。

3討論

隨著發病率的逐年上升，乳腺癌已然成為全球女性最常見的惡性腫瘤。原發性乳腺癌的5年生存率為99%，然而約有三分之一的乳腺癌患者會出現遠處轉移，多發生在確診后的5年內，并對患者的發病率和死亡率產生重大影響。一旦發生遠處轉移，患者5年生存率將會驟降至約23%[18]。乳腺癌具有向骨、肝、腦以及肺轉移的傾向，稱之為器官趨向性[19-21]。因此乳腺癌的侵襲和轉移的問題逐漸成為目前研究的熱點。研究發現，有多條信號通路與乳腺癌的發生發展有關，并對乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移有重要的調節作用[22-23]。核糖體是普遍存在于細胞中的一種高度精密的細胞器，是生物體細胞內的蛋白質合成工廠，核糖體的生物合成過程是細胞內最復雜的過程，大量調節因子和信號通路共同參與核糖體的生物合成。由于腫瘤細胞需要大量核糖體以維持自身的快速生長[24-25]，因此針對核糖體的生物合成過程進行干預有望為乳腺癌的治療提供新的途徑。

RRS1蛋白是影響核糖體合成的關鍵因子，參與多種腫瘤的發生和發展。在視網膜母細胞瘤中，RRS1蛋白通過激活AKT/mTOR信號通路促進視網膜母細胞瘤細胞增殖和侵襲[26]。miRNA-148A能夠下調RRS1蛋白表達，抑制宮頸癌的增殖和侵襲，并促進其凋亡[18]。在甲狀腺乳頭狀癌中，RRS1蛋白表達下調抑制了其增殖并誘導其發生凋亡[14]。WANG等[13]的研究發現，通過慢病毒shRNA抑制RRS1的表達后，可顯著抑制肝細胞癌細胞的集落生成能力，同時誘導細胞周期停滯在G1期。此外，研究還發現，RRS1蛋白對腫瘤細胞中P53通路具有重要影響[27-28]。RRS1蛋白在核仁中招募核糖體蛋白L11（RPL11）并參與組成5S核糖核蛋白顆粒（5S RNP）[29]，當降低細胞內的RRS1的表達以后，RPL11會從5S RNP中游離出來并與鼠雙微體基因2（MDM2）結合，從而抑制MDM2對P53的泛素化，最終激活P53[5，19-21]。研究表明，RRS1在肝細胞癌中拷貝數增加，并通過RPL11-MDM2-P53通路促進肝細胞癌的發展[17]。由此可以推測，RRS1與腫瘤細胞的發生發展密切相關。但RRS1在人乳腺癌增殖和侵襲轉移中的作用尚不清楚。

本研究通過建立MDA-MB-468細胞的RRS1敲降模型，探討RRS1在MDA-MB-468增殖和轉移中的作用。Western Blot實驗結果顯示，乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7細胞當中RRS1蛋白的表達水平均明顯高于正常HMEC，提示腫瘤細胞中有較高水平的RRS1蛋白以維持其旺盛的生理活動。為進一步探討相關作用機制，本研究以sh-RRS1慢病毒感染MDA-MB-468細胞48 h后，采用RT-qPCR和Western Blot實驗檢測慢病毒對RRS1基因的敲降效果，實驗結果顯示敲降RRS1基因顯著減少了MDA-MB-468細胞RRS1 mRNA和蛋白的表達。CCK-8實驗結果顯示，敲降RRS1顯著抑制了MDA-MB-468細胞的增殖活力，對敲降RRS1的MDA-MB-468細胞進行劃痕實驗、Transwell實驗及侵襲實驗顯示，敲降RRS1后MDA-MB-468細胞的遷移能力和侵襲能力明顯下降。上述結果表明，RRS1蛋白能夠促進乳腺癌細胞MDA-MB-468的增殖和轉移，而敲降RRS1基因后可降低乳腺癌細胞MDA-MB-468的增殖和轉移能力。提示RRS1蛋白對腫瘤細胞的增殖能力有明顯的促進作用。

綜上所述，乳腺癌MDA-MB-468細胞在敲降RRS1基因后表現出明顯的增殖抑制現象，并且侵襲能力和遷移能力也明顯減弱，提示RRS1在乳腺癌的增殖、遷移和侵襲過程中發揮了重要作用。本研究首次從細胞水平上探討了乳腺癌細胞侵襲和轉移機制，為開發新的乳腺癌治療靶點提供了數據參考，但具體的分子機制還需要后續進一步探討。

作者聲明：王潤澤、侯琳參與了實驗設計；王潤澤、彭翠修、宋軍瑩進行了實驗；王潤澤參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強）