吳茱萸堿對人肺癌NCI-H1299細胞抗腫瘤作用及其機制

雷天翔 劉震超 徐慧軍 劉光 劉麗平 葛科立

［收稿日期］2022-03-17;? ［修訂日期］2023-10-07

［基金項目］山東省重點研發計劃項目（2017GSF218084）

［第一作者］雷天翔（1986-），男，碩士研究生。

［通信作者］葛科立（1984-），男，博士，講師。E-mail：472-733278@qq.com。

［摘要］? 目的

探討吳茱萸堿（EVO）在人肺癌NCI-H1299細胞中的抗腫瘤作用及其可能機制。

方法? 應用CCK-8法檢測EVO（1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μmol/L）處理24、48、72 h對NCI-H1299細胞活力的影響，采用PI單染流式法和Annexin V-FITC+PI雙染流式法分別檢測EVO對NCI-H1299細胞周期和細胞凋亡的影響，Western blot法檢測相關蛋白表達。

結果? 與二甲基亞砜（DMSO）對照組相比，EVO能顯著抑制NCI-H1299細胞的增殖活性，細胞增殖活力隨著EVO濃度增加呈下降趨勢，不同給藥濃度組間比較差異有顯著性（F=5 091.83，P＜0.01），不同時間點間比較差異有顯著性（F=1 241.80，P＜0.01），且細胞增殖活力變化呈濃度和時間依賴性。12.5 μmol/L EVO處理細胞24 h后，與DMSO對照組相比，NCI-H1299被阻滯于G2/M期，NCI-H1299細胞凋亡率顯著上升（t=35.52，P＜0.001），細胞周期相關蛋白Cdc2磷酸化水平及P53、CyclinB1、Cdc25C（間期）蛋白水平明顯上升（F=13.55～69.14，P＜0.05），細胞凋亡相關蛋白胱天蛋白酶-3（caspase-3）、胱天蛋白酶-9（caspase-9）和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）表達增高（F=21.62～196.54，P＜0.05），B細胞淋巴瘤因子-2（Bcl-2）/Bcl-2相關X蛋白（Bax）比值明顯降低（F=3.86，P＜0.05），受體相互作用蛋白1（RIP1）、受體相互作用蛋白3（RIP3）和混合系激酶區域樣蛋白（MLKL）磷酸化水平明顯上升，差異均有統計學意義（F=71.69～118.33，P＜0.05）。

結論

EVO可在NCI-H1299細胞中誘導細胞增殖抑制、G2/M細胞周期阻滯、內源性凋亡和程序性壞死，從而發揮抗腫瘤作用。

［關鍵詞］? 吳茱萸堿；肺腫瘤；細胞增殖；細胞周期；細胞凋亡；壞死性凋亡

［中圖分類號］? R284;R734.2

［文獻標志碼］? A

［文章編號］? 2096-5532（2024）01-0057-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.002

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］? https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240227.0938.001;2024-02-28? 14：43：38

Antitumor effect of evodiamine on human lung cancer NCI-H1299 cells and its mechanism

＼ LEI Tianxiang， LIU Zhenchao， XU Huijun， LIU Guang， LIU Liping， GE Keli

＼ （Institute of Integrative Medicine， Qingdao University Medical College，? Qingdao 266023， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the antitumor effect of evodiamine （EVO） on human lung cancer NCI-H1299 cells and its possible mechanism.

＼ Methods＼ CCK-8 assay was used to observe the effect of EVO （1.0， 2.5， 5.0， 7.5， 10.0， 12.5， and 15.0 μmol/L） on the viability of NCI-H1299 cells after 24， 48， and 72 h of treatment; PI staining and Annexin V-FITC+PI double staining were used to observe the effect of EVO on the cell cycle and apoptosis of NCI-H1299 cells; Western blot was used to mea-

sure the expression of proteins.

＼ Results＼ Compared with the dimethyl sulfoxide （DMSO） control group， EVO significantly inhi-

bited the proliferative activity of NCI-H1299 cells， and cell proliferative activity tended to decrease with the increase in EVO concentration; there was a significant difference between different concentration groups （F=5 091.83，P<0.01） and between different time points （F=1 241.80，P<0.01）， and cell proliferative activity changed in a concentration- and time-dependent manner. After the cells were treated with 12.5 μmol/L EVO for 24 h， NCI-H1299 cells were arrested in G2/M phase compared with the DMSO control group， and there were significant increases in the apoptosis rate of NCI-H1299 cells （t=35.52，P<0.001）， the phosphory-

lation level of the cell cycle-related protein Cdc2， and the levels of P53， CyclinB1， and Cdc25C （mitotic phase） proteins （F=13.55-69.14，P<0.05）. There were also significant increases in the expression levels of the cell apoptosis-related proteins caspase-3， caspase-9， and PARP1 （F=21.62-196.54，P<0.05）， a significant reduction in B-cell lymphoma factor-2/Bcl-2-associated X-protein ratio （F=3.86，P<0.05）， and significant increases in the phosphorylation level of receptor-interacting protein 1， receptor-interacting protein 3， and mixed-lineage kinase domain-like protein （F=71.69-118.33，P<0.05）.

＼ Conclusion＼ EVO can induce the inhibition of cell proliferation， G2/M cell cycle arrest， endogenous apoptosis， and programmed death of NCI-H1299 cells， thereby exerting an antitumor effect.

［Key words］＼ evodiamine; lung neoplasms; cell proliferation; cell cycle; apoptosis; necroptosis

非小細胞肺癌（NSCLC）是一種致死率很高的惡性腫瘤［1］，在肺癌的組織學類型中占比最高（約85%）［2］。近年來的臨床研究顯示，NSCLC發病率和病死率均呈上升趨勢，其治療主要以手術治療、放化療為主，但仍存在高復發、轉移和耐藥等問題預示了病人預后極差。迄今為止，肺癌發生發展的分子機制尚未完全明確。因此，更好地了解有關肺癌發生發展機制將有助于指導臨床治療［3］。中草藥具有增效減毒、穩定瘤體、抑制復發和轉移的作用。從中藥中提取的活性抗腫瘤成分具有多靶點治療的優勢，逐步引起人們的重視［4］。吳茱萸堿（EVO）是從吳茱萸果實中提取的一種有效成分，具有抗腫瘤作用［5-6］。本研究旨在探討EVO在人肺癌細胞NCI-H1299中的抗腫瘤作用及其可能的作用機制。

1? 材料和方法

1.1? 實驗材料

1.1.1? 細胞系? 人肺腺癌細胞NCI-H1299購置于國家細胞資源中心。將NCI-H1299細胞放置于37 ℃、體積分數0.05 CO2培養箱內，用含體積分數0.10胎牛血清的DMEM/High Glucose培養液培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.1.2? 抗體與試劑? EVO購自Selleck，用二甲基亞砜（DMSO）配制成濃度為40 μmol/L的儲存液，－80 ℃儲存。DMEM/High Glucose培養液（HyClone）；胎牛血清；磷酸鹽緩沖液（PBS，HyClone）；2.5 g/L胰蛋白酶（Gbico）；DMSO、Cell Counting kit（CCK-8）試劑盒、碘化丙啶（PI）試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒（上海翊圣公司）。兔抗鼠一抗Cdc2、磷酸化Cdc2（p-Cdc2）、Cdc25C、CyclinB1、胱天蛋白酶-3（caspase-3）、胱天蛋白酶-9（caspase-9）、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）、受體相互作用蛋白1（RIP1）、受體相互作用蛋白3（RIP3）、p-RIP1、p-RIP3、P53、β-actin（CST）；山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗（Affinity）。

1.2? 實驗方法

1.2.1? CCK-8法檢測NCI-H1299細胞增殖? 取對數生長期的NCI-H1299細胞，用2.5 g/L胰酶消化，制成單細胞懸液，以每孔2×103個接種于96孔板。DMSO對照組加入含1.0 g/L DMSO的培養液，實驗組EVO的終濃度分別為1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 μmol/L，每組3個復孔。分別培養24、48、72 h后，每孔以換液形式加入含有100 g/L CCK-8試劑的培養液，37 ℃孵育1 h，用酶標儀檢測450 nm波長下的吸光度（A450）。

1.2.2? PI單染流式細胞術法檢測EVO對NCI-H1299細胞周期的影響? 取對數生長期的NCI-H1299細胞，用2.5 g/L胰酶消化，制成單細胞懸液，以每孔1×106個接種于10 cm培養皿。第2天，DMSO對照組加入含1.0 g/L DMSO的培養液，實驗組EVO的終濃度為12.5 μmol/L，每組3個復孔，培養24 h。處理結束后細胞經胰酶消化，離心、棄上清，加入體積分數0.70的預冷乙醇于4 ℃下保存過夜。以PBS洗滌2次，離心，加入RNase（10 mg/L），室溫孵育15 min，加入10 mg/L PI，室溫避光孵育30 min，上機檢測。

1.2.3? Annexin V+PI雙染方法檢測EVO對NCI-H1299細胞凋亡的影響? 取對數生長期的NCI-H1299細胞，細胞處理同1.2.2。處理結束后細胞經胰酶消化，離心、棄上清，以PBS洗滌2次，離心，加入含5 μL Annexin V和10 μL PI的Annexin V Binding Buffer，室溫避光孵育15 min，上機檢測。

1.2.4? Western blot檢測蛋白表達? 取對數生長期的NCI-H1299細胞，細胞處理同1.2.2。用RIPA裂解液提取樣品蛋白，BCA蛋白定量后取20 mg蛋白用100～150 g/L SDS-PAGE凝膠電泳分離，濕轉膜。將PVDF膜浸入50 g/L BSA封閉液中，室溫搖床孵育1 h。加入一抗（以含50 g/L BSA的TBST稀釋，稀釋比例均為1∶1 000），室溫搖床孵育2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗（以含50 g/L脫脂奶粉的TBST稀釋，稀釋比例均為1∶5 000），室溫搖床孵育2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。顯影。

1.3? 統計學方法

采用Flowjo10.4軟件分析PI單染流式細胞術與Annexin V+PI雙染流式細胞術檢測結果，繪制統計圖表；采用SPSS 26.0軟件進行數據統計分析。正態性分析采用Shapiro-Wilktest檢驗。計量資料數據采用±s形式表示，組間比較采用student t檢驗或單因素方差分析；重復測量數據組間比較采用重復設計多水平方差分析，事后檢驗采用Bonferroni校正法。由于相關線性假設無法成立，故采用stata16.0軟件運用局部加權回歸散點平滑法（LOWESS）觀察二維變量之間的關系，分析3個時間點（處理24、48、72 h）NCI-H1299存活細胞數和給藥濃度之間的變化趨勢，并進一步采用Bootstrap法驗證趨勢的穩定性，采用局部多項式回歸方法（LOESS方法）對兩維散點圖進行平滑分析，比較Bcl-2/Bax比值與Bcl-2和Bax的變化趨勢。P＜0.05為差異有顯著性。

2? 結? 果

2.1? EVO對人肺癌NCI-H1299細胞的增殖抑制作用

CCK-8檢測結果顯示，與DMSO對照組相比，1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μmol/L EVO作用于NCI-H1299細胞24、48、72 h后，能明顯抑制細胞增殖，細胞增殖活力隨著EVO濃度增加呈下降趨勢，不同給藥濃度組間比較差異有顯著性（F=5 091.83，P＜0.01），不同時間點比較差異有統計學意義（F=1 241.80，P＜0.01），給藥濃度與時間存在交互作用（F=673.46，P＜0.01），且細胞增殖活力變化呈濃度和時間劑量依賴性。見圖1。局部加權散點回歸分析顯示，3個時間點（24、48、72 h）NCI-H1299存活細胞數和給藥濃度之間的變化趨勢基本吻合，每個時間點的細胞存活數均隨著給藥濃度的增加而下降。見圖2。

2.2? EVO對人肺癌NCI-H1299細胞周期的影響

PI單染流式細胞術檢測結果顯示，12.5 μmol/L EVO作用于NCI-H1299細胞24 h后，與DMSO對照組相比，EVO組G2/M期細胞比例顯著上升（t=54.74，P＜0.001）。見圖3。另外，與DMSO對照組相比，EVO可以誘導p-Cdc2水平及P53、CyclinB1、Cdc25C（間期）蛋白表達上升（F=13.55～69.14，P＜0.05），Cdc25C（60 000）表達下降（F=34.20，P＜0.05）。見圖4。

2.3? EVO對人肺癌NCI-H1299細胞凋亡的影響

Annexin V/APC+PI雙染流式細胞術檢測結果顯示，12.5 μmol/L EVO處理24 h后，與DMSO對照組相比較，EVO組細胞凋亡率明顯上升（t=35.52，P＜0.001）。見圖5。與DMSO對照組相比，EVO可以誘導caspase-3、caspase-9（37 000）、Bax、PARP1以及caspase-9（35 000）表達（F=21.62～196.54，P＜0.05）。見圖6。EVO可以誘導Bcl-2/Bax比值明顯下降（F=3.86，P＜0.05）。見圖7。

2.4? EVO對人肺癌NCI-H1299細胞程序性壞死的影響

與DMSO對照組相比較，EVO組RIP、RIP3和MLKL磷酸化水平均顯著上升，差異有統計學意義（F=71.69～118.33，P＜0.05），即EVO可誘導其活化。見圖8。

3? 討? 論

EVO是蕓香科植物吳茱萸的主要成分之一，屬于吲哚喹唑啉類生物堿，具有較好的抗腫瘤作用［7］。本研究結果顯示，EVO能顯著抑制NCI-H1299細胞增殖，不同給藥濃度組之間存在顯著差異，且給藥

濃度與時間存在交互作用，且細胞增殖活力變化呈濃度和時間劑量依賴性。提示EVO可能對NCI-H1299細胞增殖有抑制作用。研究顯示，EVO作用于人乳癌MDA-MB-231細胞或人胃癌SGC-7901細胞后，可誘導細胞G1期阻滯和G2/M期細胞比例升高［8-9］。本文實驗結果顯示，EVO作用于NCI-H1299細胞后，G2/M期細胞比例明顯上升。

抑癌基因p53位于人染色體17p13.1上，編碼一種393個氨基酸的內磷酸化蛋白質，稱為P53蛋白［10］。Cdc2基因只有與Cyclin結合并經磷酸化/脫磷酸化修飾后才能發揮其活性［11］。CyclinB持續升高可使細胞停滯于分裂期，當細胞發生G2/M期阻滯時，CyclinB不但沒有快速降解，反而發生蓄積現象［12］。G2/M期的停滯是由于Cdc家族蛋白和細胞周期蛋白復合體（如Cdc2/CyclinB復合體）的順序激活和失活所致，該復合體與有絲分裂的進入有關，從而調節G2/M期的轉變。Cdc2的Tyr15磷酸化抑制了Cdc2/CyclinB1激酶復合體的活性。Cdc2中Tyr15的去磷酸化是由Cdc25C磷酸酶催化的，該反應被認為是進入有絲分裂的限速步驟［13］。本研究結果顯示，EVO處理NCI-H1299細胞后，細胞周期相關蛋白Cdc2磷酸化水平及P53、CyclinB1、Cdc25C（間期）蛋白水平明顯上升，提示EVO可使NCI-H1299細胞停滯于G2/M期。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，細胞凋亡的失控是腫瘤細胞生長和增殖的重要機制之一［6］。抗腫瘤藥物可通過內源性線粒體或內質網通路，使細胞內的caspase-9、caspase-7、caspase-3依次被激活，誘導腫瘤細胞凋亡。caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡蛋白酶之一，活化后的caspase-3可誘導細胞程序性死亡［14］。caspase-9是線粒體凋亡通路的關鍵蛋白酶，一旦激活，caspase-9就會裂解并激活caspase-3和caspase-7，從而導致細胞凋亡［15］。PARP1是研究最多的PARP家族酶之一，是將凋亡誘導因子從線粒體轉位到細胞核所必需的，參與了程序性細胞死亡過程［16］。本研究顯示，EVO作用于NCI-H1299細胞后，caspase-9、caspase-3和PARP1蛋白剪切型明顯上升，提示EVO可能在NCI-H1299細胞內誘導caspase-9、caspase-3以及PARP1的活化。Bcl-2和Bax為細胞凋亡通路中的兩種重要的基因，二者的表達是決定細胞在體內受到刺激后是否發生凋亡的重要因素［17］。Bax基因可誘導細胞凋亡，而Bcl-2具有明顯抑制細胞凋亡的作用。高Bax和（或）低Bcl-2以及高Bax/Bcl-2比值有利于細胞凋亡［18］。本研究結果顯示，EVO作用于NCI-H1299細胞后，Bax蛋白水平明顯上升，且Bcl-2/Bax比值明顯下降，提示EVO可誘導NCI-H1299細胞內源性凋亡。

程序性壞死是由蛋白激酶介導的非依賴半胱天冬酶，通過受體相互作用的一種新型細胞死亡方式。由RIP1、RIP3以及MLKL組成的蛋白復合物是程序性壞死的關鍵調控因子［19］。當被病毒感染或者caspase-8激活受抑制時，死亡配體（包括腫瘤壞死因子、FAS配體和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體）依次進行磷酸化和激活RIP1、RIP3，活化的RIP3使MLKL磷酸化，導致MLKL的構象變化，p-MLKL形成寡聚體，并易位至生物膜上，通過形成孔道和破壞膜完整性導致壞死［20-22］。本研究結果顯示，EVO作用于NCI-H1299細胞后，RIP1、RIP3和MLKL的蛋白磷酸化水平顯著上升，提示EVO在NCI-H1299細胞中能夠通過誘導RIP1、RIP3和MLKL活化，引起程序性壞死。

綜上所述，EVO對人肺癌細胞NCI-H1299具有明顯的抗腫瘤活性，其作用機制與細胞增殖抑制、誘導G2/M期細胞周期阻滯、內源性凋亡和程序性壞死有關。然而，這需要進一步的動物體內實驗進行驗證。

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（本文編輯? 牛兆山）