PRSS1 c.455-33C>T突變在遺傳性胰腺炎中的致病性分析

［收稿日期］2022-10-05;" ［修訂日期］2024-01-28

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（82270676）；2021山東省研究生教學改革研究項目（SDYJG21110）；青島市中醫藥科技項目（2021-zyym26）；青島市醫藥衛生科研計劃項目（2021-WJZD-191）

［第一作者］張雨（1997-），女，碩士研究生。

［通信作者］雷珂（1974-），女，博士，副教授。E-mail：leike-

@qdu.edu.cn。

［摘要］" 目的

探討人陽離子胰蛋白酶原（PRSS1）c.455-33Cgt;T內含子雜合突變在遺傳性胰腺炎（HP）中的致病性。

方法" 報告1例反復發作的急性胰腺炎病人，病人攜帶PRSS1 c.455-33Cgt;T雜合突變，檢索文獻及網站初步分析其突變。提取健康對照者外周血基因組DNA，通過PCR擴增將PRSS1基因3號內含子序列、4號外顯子序列和4號內含子序列與pSPL3載體連接構建質粒，命名為SWT；在SWT質粒的基礎上通過定點突變的方法構建PRSS1 c.455-33Cgt;T突變質粒，命名為S33；轉染人胚腎細胞（Hek293T）后提取總RNA并進行RT-PCR及凝膠電泳，分析PRSS1 c.455-33Cgt;T內含子突變是否引起PRSS1 mRNA剪切的改變進而引起HP。PCR擴增健康對照者外周血基因組DNA，將PRSS1基因3號內含子序列與增強子分析質粒pGL4.23連接，命名為EWT質粒；并在EWT質粒的基礎上構建PRSS1 c.455-33Cgt;T定點突變的質粒，命名為E33；將EWT、E33質粒轉染Hek293T后利用雙熒光素酶報告基因分析系統進行熒光素酶活性測定，分析PRSS1 c.455-33Cgt;T內含子突變是否通過具有增強子功能引起PRSS1基因功能發生改變進而導致HP。

結果" 檢索文獻及網站確定PRSS1 c.455-33Cgt;T突變為未報道的功能不明新突變。剪切分析實驗顯示，SWT和S33兩組RT-PCR產物相同；雙熒光素酶實驗結果顯示，E33組的熒光值低于EWT組，差異有統計學意義（t=12.23，Plt;0.001），E33組與EWT組相比沒有增強子功能。

結論" PRSS1 c.455-33Cgt;T內含子突變不引起PRSS1 mRNA剪切的改變，也不具有PRSS1基因增強子功能，與PRSS1基因直接導致的HP無關。

［關鍵詞］" 胰腺炎；人陽離子胰蛋白酶原；基因；突變

［中圖分類號］" R576

［文獻標志碼］" A

［文章編號］" 2096-5532（2024）01-0023-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.024

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］" https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240326.1141.005;2024-03-28" 16：08：58

Pathogenicity of PRSS1 c.455-33Cgt;T mutation in hereditary pancreatitis

＼ ZHANG Yu， LI Xiaoyu， WANG Jia， ZHANG Wenqing， ZHAO Xiangzhong， LEI Ke

＼ （Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the pathogenicity of human cationic trypsinogen （PRSS1） c.455-33Cgt;T intron hete-

rozygous mutation in hereditary pancreatitis （HP）.

＼ Methods＼ This article reported a patient with recurrent acute pancreatitis carrying PRSS1 c.455-33Cgt;T heterozygous mutation， which was analyzed based on related literature and websites. Peripheral blood genomic DNA was collected from healthy controls， and PCR amplification was used to connect the intron 3， exon 4， and intron 4 sequences of the PRSS1 gene with pSPL3 vector to construct SWT plasmid. The PRSS1 c.455-33Cgt;T mutant plasmid， named the S33 plasmid， was constructed by site-directed mutagenesis on the basis of SWT plasmid. After human embryonic kidney Hek293T cells were transfected with the S33 plasmid， total RNA was extracted for RT-PCR and gel electrophoresis to investigate whether PRSS1 c.455-33Cgt;T intron mutation caused the change of PRSS1 mRNA cleavage and led to HP. PCR amplification was performed for peripheral blood genomic DNA of healthy controls to connect the intron 3 sequence of the PRSS1 gene with pGL4.23 vector， namely the EWT plasmid， and the E33 plasmid of PRSS1 c.455-33Cgt;T mutation was constructed based on the EWT plasmid. After Hek293T cells were transfected with EWT and E33 plasmids， dual-luciferase reporter assay was used to measure luci-ferase activity， and the results were analyzed to determine whether PRSS1 c.455-33Cgt;T intron mutation had enhancer function to cause the change of PRSS1 gene function and lead to HP.

＼ Results＼ The search of relatedliterature and websites identified PRSS1 c.455-33Cgt;T mutationas an unreported new mutation of unknown function. The shear analysis experiment showed that

the SWT and S33 groups had identical products. The dual-luciferase reporter assay showed that the E33 group had a significantly lower fluorescence value than the EWT group （t=12.23，Plt;0.001）. The E33 group showed no enhancer function compared with the EWT group.

＼ Conclusion＼ PRSS1 c.455-33Cgt;T intron mutation does not cause changes in PRSS1 mRNA cleavage and does not have the function of PRSS1 gene enhancer， and it is not associated with HP directly caused by the PRSS1 gene.

［Key words］＼ pancreatitis; human cationic trypsinogen; gene; mutation

遺傳性胰腺炎（HP） 是一種罕見的常染色體顯性遺傳性疾病，約占胰腺炎總數的1%［1］，可以引發急性復發性和慢性胰腺炎［2］。目前已知的HP相關基因主要有人陽離子胰蛋白酶原（PRSS1）、絲氨酸肽酶抑制因子Kazal型1（SPINK1）、糜蛋白酶C（CTRC）、囊性纖維跨膜轉導調節子（CFTC）和羧肽酶A1（CPA1）［3］。其中，PRSS1基因突變被認為是導致HP的主要原因。我們在前期研究中發現1例不明原因的反復發作的急性胰腺炎病人攜帶PRSS1 c.455-33Cgt;T內含子雜合突變［4］，在clinvar中未發現這一突變，在PubMed中未見相關突變的病例報道。內含子突變可影響選擇性剪切，可作為轉錄增強子影響基因的表達［5］。本文對該臨床表型明確病人所攜帶的新突變PRSS1 c.455-33Cgt;T進行功能研究以明確其致病性。

1" 資料和方法

1.1" 臨床資料

病人，女，69歲。因“間斷上腹痛”于2020年6月首次發病入院。病人無明顯誘因出現持續性上腹痛，無肩部及背部放射痛，彎腰抱膝位可稍緩解。既往無吸煙及飲酒史，無外傷手術史，否認家族遺傳病史。入院體檢：上腹肌緊張，有壓痛、無反跳痛，其余未見異常。實驗室檢查：白細胞增多（12.60×109/L），中性粒細胞增多（9.98×109/L），血淀粉酶明顯增高（1 953.00 U/L），血糖明顯升高（17.6 mmol/L）。上腹部核磁動態增強掃描示胰頭稍飽滿、主胰管略擴張，胰膽管核磁造影成像示主胰管略擴張。診斷為急性胰腺炎。入院給予禁飲食、抑酸、生長抑素抑制胰液分泌、烏司他丁抑制胰酶活性及補液等治療，病人病情好轉出院。其后病人類似癥狀反復發作數次，均住院經非手術治療后癥狀緩解出院。為了進一步明確診斷，對病人進行了PRSS1基因熱點突變檢測，發現PRSS1 c.455-33Cgt;T內含子雜合突變。

1.2" 網站突變功能預測

在網站clinvar（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/？gr=0amp;term=prss1%5Bgene%5Damp;redir=gene）中對PRSS1 c.455-33Cgt;T突變進行查找，確定是否收錄該突變；然后在Lncipedia網站中（https：//lncipedia.org/）對該突變進行了lncRNA預測；在PubMed（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）中對該突變進行檢索。

1.3" PRSS1 c.455-33Cgt;T突變剪切功能及增強子功能驗證

1.3.1" 實驗材料" 人胚腎Hek293T細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）；Lipofectamin3000轉染試劑盒-L3000001、FastDigest enzyme-FD0524（Thermo Fisher Scientific公司）；DMEM培養基（meilunbio，MA0212）；RNA-easy Isolation Reagent-R701、2×Phanta Flash Master Mix-P510-01、2×Clon Express Mix-C115-01AA、2×Universal Ligation Mix-C311-01/02、FastPure EndoFree Plasmid Maxi Kit （DC202，Vazyme）；Evo M-MLV反轉錄試劑盒（Accurate Biology公司，AG11711）；柱式血液基因組DNA抽提試劑盒-B518253-0100，Agarose以及Regular （生工生物工程公司，A620014）；50×TAE緩沖液-T1060、100 bp DNA Ladder-M1200、6×DNA Loading-D1010，LB營養瓊脂-L8290，LB肉湯-L8291（Solarbio）；TS-GelRed核酸染料-TSJ003，Tstbl3感受態細胞，pGL4.23質粒，包含PRSS1 intron3所有序列的質粒，DNA凝膠回收試劑盒-TSP601（北京擎科生物科技有限公司）；pSPL3質粒（贈與）；無內毒素質粒小提試劑盒（康為世紀公司，CW2106S）；Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega，E1960）；引物及其序列（華大基因）見表1。

1.3.2" 細胞培養與質粒轉染" 將Hek293T細胞復蘇后放入細胞培養箱中進行培養，待細胞培養到一定數量后消化接種于35 mm細胞培養皿，按照Lipofectamin3000轉染試劑盒說明書進行質粒轉染。

1.3.3" 質粒構建" 采集健康對照者外周血3 mL于EDTA抗凝管中，應用血液基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，利用表1中引物3、4將PRSS1基因intron3序列和PRSS1基因intron3-exon4-intron4序列擴增后，分別與pGL4.23、pSPL3載體（表1中1、2）連接（圖1），轉化Tstbl3感受態細胞，在LB固體培養基上37 ℃過夜培養，挑取單菌落進行測序（華大基因），取測序成功菌液擴大培養后進行質粒小提。將質粒分別命名為EWT、SWT。

1.3.4" PRSS1 c.455-33Cgt;T定點突變質粒構建

在EWT、SWT的基礎上用表1中定點突變引物5進行擴增后，用2×Universal Ligation Mix進行連接，轉化Tstbl3感受態細胞，在LB固體培養基上37 ℃過夜培養，挑取單菌落進行測序（華大基因），將測序成功菌液擴大培養后進行質粒小提，將質粒分別命名為E33、S33。

a：以pGL4.23為載體插入PRSS1 intron3基因序列構建EWT質粒；b：以pSPL3為載體插入PRSS1 intron3-exon4-intron4基因序列構建SWT質粒。

1.3.5" 逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）擴增目的片段" ①擴增目的基因片段及點突變擴增：總反應體系50 μL，內含2×Phanta Flash Master Mix 25 μL、上下游引物各2 μL、DNA 1 μL、超純水20 μL。置于PE9700熱循環儀上，程序為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 5 s，循環35次；72 ℃ 1 min。②RT-PCR：總反應體系10 μL，內含DNA聚合酶5.0 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA 1.0 μL、超純水3.0 μL。置于PE9700熱循環儀上，程序為：94 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s；65 ℃ 30 s，0.5 ℃/Cycle，72 ℃ 1 min循環20次，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環15次，72 ℃延長5 min。最后4 ℃保存。③逆轉錄：反應體系及程序均按照Evo M-MLV反轉錄試劑盒說明書進行。

1.3.6" 凝膠電泳檢測擴增片段" 將0.45 g瓊脂糖粉末加入30 mL的1×TAE溶液中配制15 g/L制膠液，并加入3 μL的10 000×GelRed后倒入制膠器，電源設置120 V，進行20 min凝膠電泳。

1.3.7" 熒光素酶活性的檢測" 將質粒EWT、E33" 500 ng分別與 Renilla Luciferase 內參質粒2.5 ng共轉入24孔板中的 Hek293T細胞，轉染48 h后棄培養液，每孔加入100 μL 1×Passive Lysis Buffer，于搖床上室溫搖15 min。按照雙熒光素酶報告基因分析系統（Promega）操作手冊進行熒光素酶活性測定。

1.4" 統計學處理

使用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計學處理。計量資料比較采用t檢驗，Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2" 結" 果

2.1" 突變初步分析

在clinvar網站中對PRSS1 c.455-33Cgt;T突變進行查找發現并沒有收錄該突變；對該突變進行lncRNA預測發現，該區域沒有已知的lncRNA；檢索PubMed也沒有對該突變的報道。

2.2" PRSS1 c.455-33Cgt;T突變剪切功能驗證

為驗證PRSS1 c.455-33Cgt;T突變是否改變基因的剪切，將構建好的SWT、S33質粒以及pSPL3空載質粒轉染Hek293T細胞，對轉染后的細胞RNA進行RT-PCR檢測該突變引入pSPL3載體后的mRNA剪切是否發生改變。pSPL3的兩個外顯子分別為92 bp和171 bp，插入的PRSS1 exon4大小為137 bp（圖2a），SWT質粒預測有2種剪切結果，見圖2b。對RT-PCR產物進行凝膠電泳顯示，SWT與S33組產物相同，分別為400 bp和263 bp（圖2c），符合圖2b中的預測結果。表明PRSS1 c.455-33Cgt;T突變并不能引起剪切功能的改變。

2.3" PRSS1 c.455-33Cgt;T突變增強子功能驗證

pGL4.23載體含Luciferase熒光素酶報告基因及Minimal promoter基因，用于研究目的基因的增強子功能，若Luciferase熒光素酶活性上升，說明該段Minimal promoter受到增強子的調控。本研究構建以pGL4.23為載體的EWT、E33質粒，轉染Hek293T細胞后通過雙熒光素酶報告基因實驗來驗證c.455-33Cgt;T突變是否有增強子功能。結果示EWT組Ratio值高于E33組（n=7，t=12.23，Plt;0.001），見圖3。提示PRSS1 c.455-33Cgt;T突變并沒有增強子功能。

3" 討" 論

在臨床中，當病人滿足以下1個或多個標準時應考慮HP，并行基因檢測［6］：①特發性慢性胰腺炎（CP）、復發性急性胰腺炎（RAP）家族史或兒童時期不明原因胰腺炎；②有與HP相關的已知突變的親屬；③年齡25歲以下且患特發性CP；④原因不明的RAP。HP臨床表現多樣、無特異性，包括腹痛、惡心嘔吐、食欲減退、餐后上腹飽脹、脂肪瀉或腹瀉、營養吸收障礙、內外分泌功能受損、腹腔積液、脾大、膽管和十二指腸梗阻、阻塞性黃疸、假性囊腫、胰腺癌等，發作時血尿淀粉酶、脂肪酶等升高，這與其他原因引起的胰腺炎表現相類似［7-9］。1996年WHITCOMB等［10］和REBOURS等［11］在HP病人中發現第7號染色體長臂（7q35）上的PRSS1基因發生突變，與HP發病相關。PRSS1基因突變通過減少胰凝乳蛋白酶（CTRC）依賴性胰蛋白酶原降解、增加CTRC介導的激活肽加工或者直接刺激自身激活而增強了PRSS1的激活，從而導致胰腺炎發生［12］。對PRSS1基因的深入研究可以為HP的發病機制提供新的線索［13-15］。

PRSS1突變HP病人的影像學表現包括：胰腺萎縮、鈣化和胰腺主導管擴張，稱為PRSS1成像三聯征［16］。本例胰腺炎病人影像學提示主胰管擴張，且多次因RAP入院治療，排除其他常見RAP誘因外應注意存在HP的可能。本文對該病人行基因檢測，發現該病人存在PRSS1 c.455-33Cgt;T突變，且該內含子突變目前尚未有報道。

多年來，基因組序列主要側重于與其編碼蛋白質能力有關的外顯子，認為內含子序列在很大程度上是無功能的。然而，最近研究支持內含子也有功能，例如一些啟動子與位于內含子內的調節序列結合發揮轉錄增強子的作用［17］；一些內含子并不會被完全降解，產生功能性非編碼RNA副產物發揮作用［18］；也有一些內含子可作為“滯留”內含子來暫時保留在核轉錄本中，但仍可剪接，也可以通過其他機制影響基因表達；還有一些內含子通過引起非常規剪切來起作用。近年來隨著全基因組測序的出現，發現很多遺傳性疾病是由內含子的突變引起的。本文通過構建能夠用于剪切分析的SWT、S33質粒，將SWT、S33質粒分別轉染Hek293T細胞后進行分析，結果顯示PRSS1 c.455-33Cgt;T突變并不引起剪切的改變，表明該突變不是通過影響剪切導致HP的。之后又以pGL4.23為載體構建了可用于檢測插入片段的增強子活性的EWT、E33質粒，雙熒光素酶實驗結果顯示插入的突變片段導致啟動子功能減弱。然而PRSS1基因突變存在功能獲得性突變時才會引起HP，所以PRSS1 c.455-33Cgt;T突變不會直接導致PRSS1的表達增強，但是這一突變具體影響哪個基因的啟動子，現在還不清楚；該突變是否通過抑制某個基因的轉錄而促進胰腺炎發生的可能性也不能排除。后續也可以在這方面進行深入的研究。

綜上所述，隨著對RAP和慢性胰腺炎病人進行常規遺傳篩查，已知易感基因中罕見或者個體變異的發現已變得越發普遍。在缺乏遺傳證據的情況下，對變異體的功能分析可能會揭示其臨床意義［13］。因此，對于新發現的內含子突變位點進行剪切分析、探索增強子功能和非編碼RNA的相關性，對于其致病性判斷就顯得尤為重要。

（感謝意大利羅馬Sapienza大學的Bottillo Irene教授為本研究提供pSPL3載體！）

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（本文編輯" 黃建鄉）