熱休克蛋白在肌萎縮側索硬化癥中作用的研究進展

羅茂濤 張倩倩 趙慧慧 程曦 牛琦

【摘要】肌萎縮側索硬化癥（ALS）目前仍面臨發病機制不明及無有效治療措施的困境，研究發現ALS中存在顯著的蛋白穩態失調，包括蛋白質錯誤折疊和異常蛋白聚集體的形成，對ALS的起病及發展具有重要作用。其中，作為分子伴侶家族的熱休克蛋白（HSP）因具有維持蛋白穩態、促進異常蛋白聚集體降解的作用而受到了越來越多的關注。

【關鍵詞】肌萎縮側索硬化癥；蛋白質穩態；熱休克蛋白；熱休克反應；治療

【中圖分類號】R651【文獻標志碼】A【文章編號】16727770（2024）02022004

Progress on role of heat shock proteins in amyotrophic lateral sclerosis LUO Maotao， ZHANG Qianqian， ZHAO Huihui， et al. Department of Geriatric Neurology， The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210024， China

Corresponding author： NIU Qi

Abstract： At present， the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis（ALS） is still unclear and there is no effective treatment. Studies have found that there are significant protein homeostasis disorders in ALS， including protein misfolding and the formation of abnormal protein aggregates， which play an important role in the occurrence and development of ALS. As a family of molecular chaperones， heat shock proteins（HSPs） have received increasing attention due to their roles in maintaining protein homeostasis and promoting the degradation of abnormal protein aggregates.

Key words： amyotrophic lateral sclerosis； protein homeostasis； heat shock protein； heat shock response； treatment

肌萎縮側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種以上下運動神經元丟失和肌肉萎縮為特征的進行性致死性神經退行性疾病。迄今為止，已超過40多個基因被報道與ALS相關，如SOD1、 TDP43、C9ORF72等［12］。目前ALS發病機制仍不明確，近年來的研究發現，蛋白質的異常沉積及蛋白質穩態失調與ALS發病密切相關［3］，蛋白質穩態對于維持正常的細胞代謝及細胞對刺激的應答做出動態反應至關重要。其中，熱休克蛋白作為調控蛋白質穩態的重要分子之一，在誘導錯誤折疊蛋白重新折疊、促進其降解等方面的重要作用受到越來越多的關注。

1蛋白質穩態

組織及細胞功能的最佳狀態需要良好的蛋白質穩態（protein homeostasis），而穩態的平衡依賴于細胞內蛋白質質量控制（protein quality control，PQC）系統的調節，主要包括分子伴侶和降解系統。其中，分子伴侶是蛋白質穩態維持最主要的參與者，能調節蛋白質合成、折疊、轉運等多個過程［4］。

1.1熱休克蛋白熱休克蛋白（heat Shock protein，HSP）是最重要的一類伴侶蛋白，根據其大小、結構及功能進行分組［5］，目前主要分為HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和sHSPs等HSP家族。HSP是抵抗蛋白質錯誤折疊及聚集的第一道防線。作為一類重要的分子伴侶，HSP不僅發揮伴侶活性，通過與新生蛋白質相互作用，幫助穩定蛋白質并正確折疊成有效的構象；同時，HSP能啟動錯誤折疊蛋白質重新折疊或結合在這些蛋白質所暴露的黏性疏水區域，以阻斷它們互相作用和聚集［4］。此外，HSP還參與了自噬及蛋白酶體系統等降解過程［6］，清除已經形成的蛋白質聚集體。因此，HSP的抗蛋白質聚集作用在蛋白質穩態的維持中起了相當關鍵的作用。

1.2熱休克反應細胞內存在一種非常重要的內源性應激保護機制，即熱休克反應（heat shock response，HSR），受熱休克因子1（heat shock factor1，HSF1）的調控。熱應激、蛋白質毒性等能誘導HSR發生，激活HSF1，脫離與之結合的HSP90，形成三聚體HSF1。HSF1的靶基因啟動子區域有一段非常保守的DNA序列，稱為熱休克元件（heat shock element，HSE），三聚體HSF1從胞質轉運至胞核并與HSE結合，促進多種HSP基因表達上調，協同發揮作用，共同維持蛋白質穩態［7］。

2ALS的HSP失調

HSP存在于神經元的多個亞細胞結構，參與了蛋白質的合成、正確折疊、降解、解聚等過程，維護神經元內的蛋白質穩態。然而既往不少研究觀察到了ALS模型HSP的變化，如在SOD1G93A小鼠的脊髓組織勻漿中， HSP105水平出現降低［8］。最近，一項死后散發型ALS尸檢研究中，也發現了HSPA8、HSP40/70等HSP表達下降［9］。這些變化說明了HSP的改變與ALS的發病存在關聯。HSP的失調可能通過影響蛋白質穩態導致疾病的發生，因為在ALS患者或模型發現了多種蛋白質聚集體（aggregates），如mSOD1（superoxide dismutase 1）蛋白聚集體，幾乎存在于所有散發型ALS中的泛素及TDP43（TAR DNA binding protein 43）陽性包涵體［10］，多聚二肽重復蛋白（dipeptide repeat proteins，DPRs）［11］等，這是蛋白質穩態失衡的特征表現之一。

2.1HSP功能失調聚集體的存在通常被認為對神經元有毒性作用，核內聚集體可以干擾DNA轉錄或RNA加工過程。胞質內聚集體可以影響細胞膜的完整性、損傷線粒體功能、損害自噬作用等［10］。然而，有觀點認為，這些聚集體可能是PQC在處理蛋白質錯誤折疊時的副產物，或者它們可能代表細胞的一種保護方式，即隔離和存儲這些有毒蛋白質。但聚集體的存在說明，HSP可能無法阻止錯誤折疊蛋白聚集。一方面突變蛋白與HSP的作用模式發生改變，使得突變蛋白更易聚集；Ryu等［12］研究發現，錯誤折疊蛋白的表達能引起HSP70/Hsc70與底物或共伴侶結合模式的動態改變，而這種改變可能與疾病的發生發展及早期病理有關；研究表明SODIA4V的突變能促進mSODI蛋白聚集傾向區域的暴露，但并不能促進HSP70識別基序的暴露，因此易形成mSOD1聚集體［13］。另一方面已形成的聚集體能“隔離”HSP的保護作用，有研究顯示在一些突變SODI（mSODI）轉基因小鼠模型和患者死后組織中，發現了聚集體與HSP共存現象［14］；近期的一項研究也顯示，HSP能與SOD1的聚集核心發生相互作用［15］。HSP與聚集體的相互作用（共存）表明了HSP被轉移到聚集體中，因此無法執行正常的“管家（housekeeping）”功能。此外，一些研究發現HSP的突變可能與ALS的發生存在關聯，Simona等［16］在273例意大利非親緣ALS患者的隊列研究中，發現了兩種HSPB1基因突變，對變異之一（p.Ala204Glyfs*6）進行功能分析，發現突變蛋白改變了HSPB1的動態平衡，與野生型蛋白形成一個穩定的二聚體，最終導致伴侶活性的喪失。最近，一項研究對166例中國ALS患者進行二代測序，篩選出3個HSPB1基因可能的致病性罕見錯義突變［17］。

2.2HSR失調包括HSP70、HSP40、HSP90在內的一些HSP沒有被上調， 這是許多mSOD1小鼠模型的特征之一［8］。其中，很重要的原因之一是HSR沒有被有效誘導。目前已經認識到HSR在神經元中具有更高的誘導閾值。體外實驗表明，大鼠腦切片受熱應激（41～42 ℃，15～60 min）后，少突膠質細胞的HSP70及星形膠質細胞的HSP27表達增加，而神經元中未見HSP70或HSP27的表達增加［18］；一項對死后散發型ALS尸檢的研究表明，HSR在脊髓運動神經元中失調，HSF1的靶基因表達下降［9］。目前研究認為，HSR失調可能的原因是HSF1無法被有效激活，而并非表達不足［9］。近期的一項研究也顯示，在神經元中，ALS的致病蛋白，如mSOD1，是一種HSR的弱誘導劑［19］。不過另一項研究卻發現，DPRs能有效激活HSR［20］?？傊窠浽獌菻SR與聚集體的關系及內源性HSF1無法被激活的原因仍有待進一步的研究。

3HSP的抗ALS蛋白質聚集作用

大量研究已證實HSP能阻止ALS相關蛋白的聚集，維護蛋白質穩態，從而發揮神經元保護作用［2122］。目前HSP的抗蛋白質聚集作用可以歸因于兩點：（1）HSP減輕觸發致病性聚集的早期異常蛋白相互作用，根據文獻報道，HSP可以有效地延長聚集開始前的滯后期［23］，如果蛋白質聚集已經啟動，則可延長聚集體的初級及次級成核，這些作用主要是通過結合聚集蛋白質所暴露的疏水殘基來發揮作用；（2）HSP參與聚集體轉運至降解系統進行降解［6］。

3.1小HSP的作用除了HSP70外，小HSP家族在抗蛋白質聚集作用也受到了越來越多的重視。既往研究顯示，HSPB5（HSP27）和HSPB1（αBcrystallin）的過表達能夠抑制SOD1聚集［24］，而更多的研究主要集中在HSPB8（HSP22）的抗蛋白聚集作用上。HSPB8是小HSP家族成員之一，主要通過分子伴侶介導的自噬（chaperone mediated autophagy，CMA）途徑參與蛋白質穩態的維持。HSPB8能形成二聚體與HSP70及支架蛋白BAG3（BCL2associated athanogene）和E3連接酶CHIP結合，最終組成HSPB8+ HSP70+CHIP+ BAG3復合體，在微管組織中心形成自噬小體，吞噬并降解錯誤折疊蛋白。當CMA不足或受損時，HSP70和CHIP與輔助伴侶BAG1結合，形成HSPB8+HSP70+CHIP+BAG1復合體后將錯誤折疊的蛋白質靶向運送至蛋白酶體系統進行降解［25］。研究發現在疾病發病期間和疾病末期，HSPB8在轉基因ALS小鼠模型和患者的脊髓標本中表達上調［26］，在病程短的患者側束星形膠質細胞中也存在類似情況［27］，這種表達上調可能代表了細胞對錯誤折疊蛋白誘導的損傷反應，并增強這些存活運動神經元蛋白毒性應激的耐受性。HSPB8通過CMA途徑，降解毒性蛋白，因此其表達水平的上調有助于從多種致病蛋白（mSOD1、TDP35/TDP25、DPRs）的ALS神經元模型中去除聚集的錯誤折疊蛋白［2122］。最近一項研究發現，過表達的 HSP8可以保護腦內突觸可塑性和認知功能，該研究認為過表達的 HSP8可能通過調節經典功能通路和上游調控因子來促進突觸可塑性［7］。

3.2HSR的作用HSF1能介導HSR，而神經元中的HSR具有更高的激活閾值，其中原因之一是HSF1不能被有效激活。因此，HSF1的激活及隨后的多種HSP表達上調能促使錯誤折疊重新折疊、解聚或通過自噬或泛素蛋白酶體系統（ubiquitinproteasome system，UPS）被清除，阻止毒性聚集體的形成及隨后的神經損傷。既往研究表明，活性HSF1過表達能增強mSOD1H46R/H48Q小鼠的HSR，表現為小鼠脊髓提取物中可溶性的HSP70及不溶片段中HSP70及HSPB5的增加，并顯著抑制小鼠體質量減輕，延遲ALS疾病的發病，該研究認為HSF1的過表達可能改變了SOD1的溶解性，改善了運動神經元的蛋白質穩態［28］。Wang等［29］的研究顯示，HSF1能抑制TDP43乙?；M物所致的病理過程，該研究認為通過誘導HSP27/40的表達，對蛋白質進行重新折疊或降解來減少TDP43聚集體，而內源性HSF1的激活足以發揮這種作用。由此可見，HSF1的激活能使HSR增強以及多種相互作用的關鍵HSP表達上調，比單一過表達某種HSP的抗聚集作用更強。最近一項研究則發現，相比于正常衰老的小鼠，長壽的小鼠可能保存和加強了大腦中HSF1的激活［30］，印證了HSF1激活的神經保護作用。

4治療

聚集體的毒性作用很可能是導致ALS中神經變性的重要分子機制之一。而HSP在蛋白平衡網絡中起著至關重要的作用，它們在蛋白質應激下被上調，因此是受調控的。

目前一些研究涉及了對單個基因調節的治療作用。如調節HSPB8基因表達的藥物：秋水仙素、雌激素受體調節劑等。其中秋水仙素以HSPB8依賴的方式增強不溶性TDP43聚集物的清除，目前正在對一大批ALS患者進行Ⅱ期臨床試驗［31］。

與單獨上調HSP相比，作用于HSF1并上調HSR從而增加一系列應激相關蛋白的表達似乎更有能力減輕蛋白質聚集負荷，防止神經退化，延長ALS模型小鼠的壽命。目前已研究的藥物有兩類：一類治療藥物能激活HSF1和/或上調HSR下游產物。這些藥物包括醉茄素A、阿莫洛莫（arimoclomol）等，能上調HSR促使存活運動神經元的數量增加，并延長mSOD1表達小鼠的壽命［14］。另一類治療藥物是針對HSF1抑制復合物，如17AAG，可上調HSP70表達，減少HEK293T細胞中過表達易聚集的TDP43 C末端片段的病理性聚集體的數量［32］。

羥胺衍生物阿莫洛莫是一種HSR共誘導劑，能穩定處于活化狀態的HSF1，延長HSF1與HSE的結合時間，并上調一些HSP家族的表達［33］。在ALS的SOD1G93A小鼠模型中，阿莫洛莫已被證明可以延緩疾病進展，延長壽命，增加肌肉功能，并防止突變SOD1的聚集［34］。此外，最近一項研究表明，阿莫洛莫能增強HSR并改善mVCP小鼠脊髓和腦中ALS/FTD樣病理特征，并防止神經元丟失［35］。雖然阿莫洛莫第二階段200 mg每日3次劑量的安全性和耐受性試驗獲得成功［36］，但在一大群散發ALS 參與者中進行的3期研究未顯示任何益處。因此，為了確定阿莫洛莫的作用是否可以在SOD1介導的疾病中得到最充分的體現，可能需要進行一項針對攜帶mSOD1患者的更大規模試驗。

5總結與展望

蛋白平衡紊亂及隨后發生的蛋白聚集是ALS的普遍特征。雖然蛋白質聚集與神經元功能障礙和死亡之間存在很強的相關性，但它們之間的關系及機制仍然是該領域的最大問題之一。很明顯，蛋白質穩態崩潰是蛋白質聚集的關鍵部分，而HSP廣泛參與蛋白穩態的調節，其功能下降或缺失及作用模式改變都會導致蛋白質穩態失衡，最終引起蛋白質聚集及隨后的神經變性。在ALS環境中，HSP的表達與細胞存活有關，通過增加HSP水平可以增強蛋白質穩態網絡的能力仍是未來研究的一個重要領域。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

［參 考 ?文 ?獻］

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