細胞焦亡在胎盤植入患者外周血和胎盤組織中表達及臨床意義

摘要：目的" 探究胎盤植入患者外周血中炎癥因子的表達及胎盤組織中細胞焦亡因子的表達情況和臨床意義。方法" 收集2021年6月-2023年1月在我院產科入院診斷為胎盤植入30例孕婦作為胎盤植入組，妊娠期正常孕婦60例作為正常組，分析兩組孕婦的臨床資料信息。通過ELISA檢測TNF-α、IL-1β及IL-18表達情況，HE染色觀察胎盤植入的胎盤組織病理學，IHC和qPCR實驗檢測Caspase-1、GSDMD和NLRP3蛋白和mRNA在兩組孕婦胎盤組織中表達差異。結果" 胎盤植入組孕婦外周血中TNF-α、IL-1β和IL-18表達量高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；胎盤植入患者的子宮基層組織沒有蛻膜，絨毛膜絨毛直接毗鄰肌層纖維。胎盤植入組胎盤組織中細胞焦亡分子Caspase-1和NLRP3蛋白和mRNA表達高于正常組，GSDMD蛋白和mRNA表達低于正常組（P＜0.05）。結論" 細胞焦亡在胎盤植入發病機制過程中表達增加。

關鍵詞：細胞焦亡；胎盤植入；炎癥因子

中圖分類號：R714.252；Q291" " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.10.016

文章編號：1006-1959（2024）10-0083-05

Expression and Clinical Significance of Pyroptosisin Peripheral Blood

and Placental Tissues of Patients with Placenta Implantation

TANG Yu-fan，SONG Peng-shu，LI Ying，TAN Yuan-yuan，LONG Jun-qing

（Xinyang Second Department of Obstetrics，Guangxi Zhuang Autonomous Region maternal and Child Health Hospital，

Nanning 530003，Guangxi，China）

Abstract：Objective" To investigate the expression of inflammatory factors in peripheral blood of patients with placenta implantation and the expression of pyroptosis factors in placental tissues and their clinical significance.Methods" From June 2021 to January 2023， 30 pregnant women diagnosed with placenta implantation in the obstetrics department of our hospital were collected as the placenta implantation group， and 60 normal pregnant women during pregnancy were collected as the normal group. The clinical data of the two groups were analyzed. The expression of TNF-α， IL-1β and IL-18 was detected by ELISA. The histopathology of placenta implantation was observed by HE staining. The expression of Caspase-1， GSDMD and NLRP3 protein and mRNA in placenta of two groups was detected by IHC and qPCR.Results" The expression levels of TNF-α， IL-1β and IL-18 in peripheral blood of pregnant women in the placenta implantation group were higher than those in the normal group， and the differences were statistically significant （Plt;0.05）. There was no decidua in the uterine basal tissue of patients with placenta implantation， and the chorionic villi were directly adjacent to the myometrium fibers. The expression of Caspase-1 and NLRP3 protein and mRNA in placenta tissue of placenta implantation group was higher than that of normal group， and the expression of GSDMD protein and mRNA was lower than that of normal group （Plt;0.05）.Conclusion" The expression of pyroptosis is increased in the pathogenesis of placental implantation.

Key words：Pyroptosis;Placenta implantation;Inflammatory factor

胎盤植入（placenta implantation）是導致產后出血、圍產期緊急子宮切除及孕產婦死亡重要原因，孕產婦病死率為1%～7%[1]。在妊娠期間，胎盤膜外滋養層細胞（extravillous trophoblast cells， EVT）的遷移和侵入母體子宮是胎盤和胎兒正常發育的必要條件。胎盤植入是異常EVT細胞不同程度侵入子宮及以上的肌層[2]，以炎癥反應為特征受各種信號通路協調激活，這些信號通路調節胎盤組織細胞和從血液中富集白細胞中促炎性介質和抗炎介質的表達[3，4]。細胞焦亡（pyroptosis）是由某些炎性小體引發的細胞死亡的一種炎癥形式，導致GSDMD的裂解和IL-18和IL-1β等非活性細胞因子的激活[5]。近年來，細胞焦亡在婦科復發性流產、妊娠高血壓和妊娠期糖尿病都有相關性研究[6，7]。本研究通過研究細胞焦亡及其相關因子，探討胎盤植入機理，旨在為胎盤植入早期的預警診斷提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2021年6月-2023年1月在廣西壯族自治區婦幼保健院定期檢查的孕婦為研究對象。將妊娠期正常健康孕婦60例設為正常組，胎盤植入患者30例設為胎盤植入組。胎盤植入患者的納入標準：①在產檢中通過核磁共振和彩色多普勒超聲檢測評分（5～10分）確診為胎盤植入；②單胎；③剖宮產分娩。胎盤植入患者的排除標準：①多胎妊娠；②合并妊娠期高血壓（包括子癇前期）；③妊娠期糖尿??；④胎兒宮內受限及其他妊娠期并發癥；⑤臨床數據資料不全。所有研究對象均知情同意，并簽署書面知情同意書。本研究已獲廣西壯族自治區婦幼保健院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1外周血采集和炎癥因子檢測

兩組孕婦入院分娩之前抽取3 ml外周血，采血管在4 ℃，3000 r/min，離心10 min。收集上層血漿轉移到1.5 ml凍存管保存于-80 ℃。等所有樣本收集完畢之后，通過酶聯免疫吸附試劑盒（ELISA）檢測細胞焦亡因子TNF-α、IL-1β和IL-18表達情況。檢測儀器為安捷倫紫外可見光分光光度計Cary 100，ELISA試劑盒TNF-α（JM-5141H2）、IL-1β（JL13662）和IL-18（JM-1152H1）采購于深圳市優里生物科技有限公司。

1.2.2胎盤病理學形態分析

剪取娩出胎盤母體面組織塊，放置于福爾馬林固定液中。組織經過脫水和石蠟包埋，切片機切成2 μm膜片。高溫烘片之后依次浸泡二甲苯Ⅰ-Ⅴ和梯度乙醇，流水沖洗，蘇木素液染色5 min，流水清洗片子，1%鹽酸酒精1 s，流水沖洗返藍，0.5%伊紅液染色5 min，80%乙醇，95%乙醇，無水乙醇Ⅰ，無水乙醇Ⅱ，各浸泡1 s，晾干片子用中性樹膠封片。

1.2.3免疫組織化學實驗檢測胎盤組織中焦亡蛋白的表達情況

剪取娩出胎盤母體面組織塊，放置于福爾馬林固定液中。組織經過脫水和石蠟包埋，切片機切成2 μm膜片。高溫烘片之后依次浸泡二甲苯Ⅰ～Ⅴ和梯度乙醇；流水沖洗，切片在高溫EDTA中孵育20 min；自然冷卻后滴加3% H2O2溶液室溫封閉10 min；PBS沖洗3次，加一抗（Caspase-1、GSDMD和NLRP3）4 ℃過夜；PBS沖洗3次，滴加二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，加DAB顯色劑，流水沖洗，蘇木素染色，碳酸鋰分化返藍，流水沖洗，梯度乙醇脫水，晾干片子用中性樹膠封片。

1.2.4熒光定量PCR實驗檢測兩組胎盤組織中焦亡因子mRNA的表達水平

收集胎盤樣本，100 μg胎盤組織碎塊加入800 μl TRIzol提取RNA，采用Nandrop NOE儀器測定RNA濃度；按照cDNA反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA；參照賽默飛公司設計的反應程序加入cDNA，設計好的上下游引物，反應酶和水進行實時定量PCR實驗。反應程序設置為：85 ℃預變性3 min；95 ℃變性20 s；65 ℃退火40 s；75 ℃延伸35 s；40個循環，GAPDH基因作為管家基因進行PCR反應。根據PCR擴增曲線，得到兩組樣本的循環周期數（Ct值），使用2－△△Ct法計算兩組胎盤組織中Caspase-1、GSDMD和NLRP3基因的表達值。

1.3統計學方法

采用Image-Pro Plus圖像分析程序對免疫組織化學染色區所占面積進行定量分析，免疫組織化學染色面積的百分比表示在顯微鏡下黃棕色染色面積占整個面積的百分比，所有實驗數據均采用SPSS 20.0統計包程序進行統計分析，數據以（x±s）表示，兩組樣本之間采用獨立樣本t檢驗和？字2檢驗進行統計學差異分析，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2結果

2.1兩組一般資料比較

兩組的身高、體重、BMI、妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓的發生率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。胎盤植入組年齡、孕周、孕產史、前置胎盤占比及疤痕子宮占比比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2胎盤植入孕婦外周血中細胞焦亡因子的表達

胎盤植入組孕婦外周血中TNF-α、IL-1β和IL-18表達量高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2、圖1。

2.3胎盤植入孕婦胎盤組織的病理學檢測結果

胎盤植入組胎盤組織的植入部分與非植入部分比較顯示，同一胎盤的非植入區域（圖2A），絨毛（右下）和肌層（左上）之間可見蛻膜。蛻膜化的子宮內膜，下面有充血的肌層血管和肌層。植入區（圖2B）其特征是沒有蛻膜和絨毛膜絨毛，可見直接毗鄰肌層纖維，見圖2。

2.4免疫組化實驗檢測胎盤植入患者的細胞焦亡蛋白表達情況

胎盤植入組胎盤組織中細胞焦亡分子Caspase-1和NLRP3蛋白表達高于正常組，GSDMD蛋白表達低于正常組（P＜0.05），見圖3、圖4。

2.5 qPCR實驗檢測胎盤植入患者的焦亡基因表達情況

胎盤植入組胎盤組織中細胞焦亡分子Caspase-1和NLRP3 mRNA表達高于正常組，GSDMD mRNA表達低于正常組（P＜0.05），見表3、圖5。

3討論

胎盤植入包括胎盤黏連、胎盤植入和穿透性胎盤植入，是嚴重孕產婦發病和死亡的主要原因[8]。胎盤植入胎盤的潛在分子機制尚不清楚，目前提出的假說包括蛻膜或基底板的原發性缺失、母體血管重構異常和滋養層過度外侵[9]。細胞焦亡是一種獨特的程序性細胞死亡，參與免疫調節。細胞焦亡是由炎癥小體引起的，在炎癥相關疾病中起著核心作用[10]。越來越多的證據表明焦亡可能導致一系列疾病，包括自身免疫性疾病、糖尿病、神經系統相關疾病和心血管疾病[11]。

胎盤發育是通過嚴格的空間和時間調節，在妊娠期早期胎盤外滋養層細胞（EVT）遷移至子宮內膜蛻膜組織，并且侵襲在子宮肌層內大約1/3使得胎盤組織固定在子宮壁[12]。子宮內膜母胎界面特殊的免疫微環境不僅保護胎兒免受母體免疫系統的攻擊，也保護母親免受病原體的侵害[13]。胎盤植入需要細胞克服局部免疫系統、激活入侵和誘導血管生成的能力，任何成功的懷孕都依賴于胎盤介導的抑制宿主免疫反應以防止母體排斥[14]。胎盤植入常與慢性基底炎癥相關，Ernst LM等[15]在101個胎盤植入標本中發現，與因母體惡性腫瘤史而送去檢查胎盤，且無臨床胎盤植入的患者相比，植入部位淋巴細胞浸潤增加。本研究中5例胎盤植入患者都有2次以上的剖宮產和子宮內膜手術史，疤痕妊娠的發生率為100%。這類手術很容易導致母親再次妊娠期間子宮內膜出現炎癥。本研究檢測胎盤植入孕婦外周血中炎癥因子，結果發現TNF-α、IL-1β和IL-18表達值大于正常孕婦外周血中的含量，說明孕婦妊娠期發生胎盤植入后，機體會出現炎癥癥狀。

本研究的胎盤病理組織切片結果顯示，胎盤植入會導致子宮內膜蛻膜區消失，胎盤侵襲子宮肌層導致子宮肌層血管減少。正常妊娠的胎盤組織與子宮內膜之間存在子宮內膜蛻膜區這道屏障。然而，侵入性胎盤植入和侵入局部結構的方式類似于惡性腫瘤深入子宮肌層[16]。胎盤植入的兩個主要危險因素是前置胎盤和某種形式的子宮肌層損傷，幾乎總是由一次或多次下橫向剖腹產留下疤痕[17]。對于前者的危險因素，有研究認為前置胎盤宮頸周圍較薄的肌層內膜更有利于滋養層的過度侵入，因為它降低了滋養層的侵入屏障[18]。TNF-α已被證明可誘導內皮細胞炎癥和功能障礙。本研究檢測結果顯示，TNF-α因子在胎盤植入孕婦外周血中的表達高于正常孕婦的表達。Yao F等[19]的研究表明，TNF-α可誘導HUVECs中NLRP3的表達和下游Caspase-1的激活。NLRP3炎癥小體的激活是焦亡典型途徑的第一步。在pro-Caspase-1被裂解后，GSDMD被裂解為GSDMD-c和GSDMD-n結構域。隨后在焦亡過程IL-1β和IL-18成熟[20，21]。GSDMD-n在細胞膜上形成焦性孔，破壞細胞膜，將炎性細胞因子、粘附因子等細胞內容物釋放到細胞外間隙。本研究檢測結果發現細胞焦亡分子NLRP3和Caspase-1蛋白和基因在胎盤植入患者胎盤組織中的表達高于正常妊娠，GSDMD蛋白和mRNA表達降低。孕婦在經過剖宮產或者子宮手術史后，子宮內膜存在疤痕組織區域，子宮內膜蛻膜區變薄，再次妊娠容易導致胎盤植入的發生。此外，妊娠本身就是免疫排斥和接收過程，胎盤外滋養層細胞在不斷侵入子宮肌層過程中，子宮肌層蛻膜區釋放大量免疫細胞，刺激胎盤外滋養層細胞分泌TNF-α因子，不斷累積導致胎盤外滋養層細胞發生細胞焦亡反應。

綜上所述，在大多數妊娠發展情況下，胎盤正常發育是需要滋養層細胞不斷增長和分化，滋養層細胞侵入母體子宮肌層時，在妊娠前期，胎盤外滋養層細胞由上皮表型過渡到間充質表型遷移和侵襲到母體蛻膜區導致蛻膜區免疫細胞聚集。胎盤組織侵入過深就會損害其他組織器官，直接引起機體炎癥反應，免疫調控失衡。胎盤組織不斷受到母體免疫細胞的攻擊，就會發生死亡。然而，在妊娠和分娩的各個階段都觀察到免疫耐受過程的生理變化，還需要更多的數據來證明細胞焦亡在胎盤植入發生過程中有關其影響的細節。

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收稿日期：2023-06-06；修回日期：2023-06-21

編輯/肖婷婷