基于揮發性成分和多元統計分析法鑒別稻谷新陳度

摘要 本研究以2019～2023 年份收獲的稻谷為研究對象，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-三重四極桿質譜聯用方法對稻谷的揮發性成分進行檢測，結合標準質譜數據庫及保留指數建立選擇離子監測方法，通過內標法計算各個組分的含量。采用主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析對揮發性化合物進行多元統計分析，篩選出與稻谷新鮮度相關的差異化合物，建立了基于揮發性成分分析的儲藏稻谷鑒別模型。在不同年份收獲的稻谷樣本中共檢出44 種揮發性化合物，包括醛類、醇類、酮類、酸類、酯類、酚類和呋喃等。多元統計分析結果表明，根據揮發性化合物含量建立的正交偏最小二乘法判別分析模型， 2023 年收獲的稻谷與2019～2022 年收獲的稻谷可顯著區分為兩類，進一步基于變量重要性投影（VIP）值大于1 和單因素分析p 值小于0.05，確定己酸和壬酸等12 種化合物為差異化合物。本研究提出的基于揮發性成分分析的儲藏稻谷分類模型可為稻谷新陳度判定提供理論依據。

關鍵詞 稻谷；揮發性成分；氣相色譜-三重四極桿質譜；多元統計分析；分類模型

稻谷是我國三大主要糧食作物之一，富含碳水化合物、蛋白質、脂質、維生素和礦物質，是人體所需能量和多種營養素的重要來源。稻谷的儲藏是我國國家糧食安全的重要組成部分。儲藏期間，稻谷的代謝活動仍在進行，其呼吸作用趨于平穩，營養物質不斷消耗[1-2]。受收獲時水分含量、運輸條件以及儲藏期間溫度、濕度、酶、蟲害和微生物等多種因素影響，稻谷在儲藏過程中物理化學性質不斷發生改變[3-4]。其中，稻谷籽粒內部的脂質將會水解和氧化生成脂肪酸和醛酮類物質，蛋白質將會水解產生游離氨基酸，導致稻谷產生酸味和陳味[5-6]。此外，隨著儲藏時間的進一步延長，稻谷的生活力和發芽率下降、細胞膜通透性增加，代謝的有毒害產物逐漸積累，同時籽粒組織硬化，柔性與韌性變弱，發生糊化及吸水率降低。上述物理化學變化造成稻谷食用品質和營養價值下降，產生陳化現象，嚴重威脅國家糧食安全[7]。因此，研究儲藏稻谷新陳度的分析方法，對保障稻谷儲藏品質和節糧減損具有重要意義。

研究表明，儲藏期間稻谷的多種理化指標均發生不同程度的變化[8-9]。雷玲等[10]采用人工控制溫度和濕度的方法模擬稻谷陳化，并對儲藏期間水分、發芽率、脂肪酸值、降落數值、糊化特性、食用品質和微觀結構進行分析，探討了各指標與稻谷儲藏品質的相關性。周顯青等[11]以儲藏稻谷為原料，通過測定脂肪酸值、過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性、丙二醛含量、巰基含量、電導率和發芽率，分析了各指標的品質變化及差異性。黃象鵬等[8]以實倉中不同倉儲時間的早秈稻為研究對象，將檢測指標范圍進一步擴大至淀粉、蛋白質及揮發性成分的測定。此外，王鄧琳等[9]通過加速陳化方式模擬稻谷儲藏，并對富硒稻谷的α-淀粉酶活力、脂肪酶活動度、游離酚含量、糊化特性、質構特性和食味值進行分析。程曉雨等[12]對稻谷樣本以及儲藏一年后的稻谷樣本進行代謝組學研究，探討儲藏對稻谷代謝產物的影響。上述理化指標中，揮發性成分測定的前處理過程相對簡單，在儲藏稻谷品質現場實時分析中有較大的應用潛力。目前已報道的稻谷相關揮發性化合物已超過300 種[13]，包括烴類、醛類、酮類、酯類、酸類、醇類以及雜環類等[14]，研究人員通過同時蒸餾萃取[15]、超臨界流體萃取[16]、溶劑輔助風味萃取[17]和頂空固相微萃取（Headspace solid phase microextraction， HS-SPME）[18]等方法對稻谷中的揮發性成分進行富集。其中， HS-SPME 方法操作簡單、無需提取溶劑、不易受外界物質干擾且靈敏度較高，可與氣相色譜-質譜技術結合對含量較低、揮發性較弱的物質進行分離分析，已成為稻谷揮發性成分檢測的有效手段。

本研究以2019～2023 年收獲的稻谷為研究對象，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-三重四極桿質譜聯用技術（Headspace solid phase microextraction-gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry， HSSPME-GC-MS/MS）對其揮發性成分進行定性和定量分析，結合主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）等多元統計分析方法，篩選出新陳稻谷中存在的差異性成分，以期為構建基于揮發性成分的稻谷新陳度鑒別模型提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

GC8890-7010BMS/MS 氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀、PAL3 多合一自動進樣器和DVB/CarbonWR/PDMS 固相微萃取纖維（美國安捷倫公司）；SQP 電子天平（感量0.0001 g， 德國賽多利斯公司）；20 mL 頂空樣品瓶和開孔頂空磁性金屬蓋（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

2，4，6-三甲基吡啶（98%，上海吉至生化科技有限公司）；二氯甲烷（色譜純，≥99.9%，上海麥克林生化科技股份有限公司）；正己烷（色譜純，≥99.9%，北京百靈威科技有限公司）。稻谷籽粒樣品共41 份，分別于2019～2023 年采集后置于4 ℃低溫庫中保存，產地包括黑龍江省、河南省、江西省和安徽省，其中， 2019 年5 份， 2020 年5 份， 2021 年8 份， 2022 年8 份， 2023 年15 份。

1.2 實驗方法

1.2.1 固相微萃取條件

稱取5.00 g 稻谷樣品于20 mL 頂空瓶中，加入10 μL 5 μg/mL 的2，4，6-三甲基吡啶后立即密封，置于自動進樣盤上；固相微萃取頭于260 ℃預老化3 min， 樣品瓶于50 ℃平衡10 min， 以250 r/min 速度振搖萃取80 min；將萃取頭自動轉移至氣相色譜進樣口中，于250 ℃解吸4 min， 然后在260 ℃將萃取頭老化10 min。

1.2.2 色譜條件

DB-Wax UI 毛細管柱（60.0 m×0.25 mm， 0.25 μm）， 進樣口溫度為250 ℃。升溫程序如下：40 ℃保持5 min；以3 ℃/min 升溫至230 ℃， 保持15 min；230 ℃運行5 min。載氣為高純氦氣，流速1.00 mL/min。進樣方式為不分流進樣。

1.2.3 質譜條件

電子轟擊電離源（Electron impact ionization， EI），電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃， 四極桿溫度為150 ℃；數據采集方式為全掃描（Scan）和選擇離子監測（Selective ion monitoring， SIM）；質量掃描范圍為m/z 33～550；溶劑延遲15 min；參考譜庫為NIST 20.0 標準質譜庫和安捷倫香味物質數據庫。

1.2.4 數據處理方法

定性分析首先采用Mass Hunter 工作站對樣品的總離子流圖進行峰識別和峰提取，根據C7～C40 正構烷烴混合標準品的保留時間數據按公式（1）計算化合物的保留指數（Retention index， RI），通過比對NIST 20.0 標準質譜庫中的化合物質譜圖、特征離子信息、相似度匹配值和RI，對檢出的化合物進行篩查和定性分析[19]。

RI x = 100 + 100 ×（"RT（x）×RT（n）/"RT（ n+1） + RT （n"）" ）

其中， RI（x）是化合物x保留指數， n 是保留時間在化合物x 之前的正構烷烴的碳原子數， RT（x）是化合物x 的保留時間， RT（n）是碳原子數為n 的正構烷烴的保留時間， RT（n+1）是碳原子數為n+1 的正構烷烴的保留時間。

定量分析 通過優化化合物前級離子建立SIM 方法，以2，4，6-三甲基吡啶為內標物質，采用峰面積比值歸一化法計算稻谷中檢出的各種揮發性組分的相對含量[20]：

Cx＝ C0× V0× Ax/"A0" ×m

其中， Cx 為檢出物含量（μg/kg）， C0 為內標物濃度（μg/mL）， V0 為內標體積（μL）， Ax 為檢出物的色譜峰面積， A0 為內標物的色譜峰面積， m 為樣品質量（g）。

數據分析 通過峰積分獲得各揮發性風味物質的保留時間并計算保留指數和相對含量，導出數據至Microsoft Excel 2019 軟件進行數據處理；通過Chiplot（https：//www.chiplot.online/）繪制化合物分類圖；采用Origin 2019 軟件繪制柱狀圖；利用SIMCA 14.1 軟件進行多元統計分析，計算預測變量重要性投影（Variable importance in projection， VIP），以VIPgt;1、單因素分析plt;0.05 為條件篩選差異化合物，建立稻谷新陳度的鑒別模型。

2 結果與討論

2.1 稻谷中揮發性成分檢測

采用HS-SPME-GC-MS/MS 對稻谷中的揮發性成分進行非靶向分析（圖1），并對檢出的揮發性化合物進行未知物識別，以去除非呈味的烷烴和烯烴等物質。通過與NIST 20.0 標準質譜庫對照并結合計算RI進行定性分析，從41 個稻谷樣品中共鑒定出44 種揮發性化合物，結果見表1。通過條件優化確定最佳樣品用量為5.00 g、SPME 溫度為50 ℃、SPME 時間為80 min、解吸時間為4 min；依據化合物的特征前級離子信息建立稻谷揮發性成分的SIM 分析方法。

2.2 稻谷儲藏過程中揮發性成分變化規律分析

稻谷中各類揮發性成分分布如圖2A 所示，可知鑒定出的揮發性化合物可分為7 類，包括15 種醛類化合物、11 種醇類化合物、7 種酮類化合物、5 種酸類化合物、3 種酯類化合物、2 種酚類化合物和1 種呋喃類化合物。其中，醛類和醇類化合物種類較豐富，分別占總揮發性化合物的34.1%和25.0%，超過總揮發性化合物數量的1/2；其次是酮類、酸類和酯類化合物，種類分別占總揮發性化合物的15.9%、11.4%和6.8%。采用內標法對揮發性化合物進行定量分析，以2023 年收獲的稻谷為新稻谷、2019～2022 年收獲的稻谷為陳稻谷，比較不同種類揮發性化合物在新、陳稻谷中的含量變化情況，結果如圖2B 所示，稻谷中酸類和醇類化合物的含量相對較高，為主要揮發性成分，隨著儲藏時間延長，稻谷中酸類、醛類、酯類和呋喃類化合物的含量均呈上升趨勢，其中，酸類化合物含量變化較顯著；醇類和酮類化合物含量在新、陳稻谷中的變化趨勢不明顯；酚類物質在新稻谷中含量較高，隨儲藏時間延長而呈下降趨勢。稻谷中脂質降解后會產生低級脂肪酸，使其酸度增加；脂肪酸氧化產生氫過氧化物并進一步降解為醛類、酮類、醇類和呋喃類化合物，這是稻谷產生揮發性成分的主要途徑，影響稻谷的食用品質和營養價值[21-22]。

2.3 新陳稻谷揮發性成分多元統計分析

為探究新、陳兩類稻谷中揮發性成分差異，以44 種揮發性化合物為因變量，新、陳稻谷為自變量，對鑒定出的44 種揮發性化合物進行多元統計分析。主成分分析結果如圖3A 所示，大部分樣品處于95%置信區間內，其中，主成分1 貢獻總方差的71.5%，主成分2 貢獻總方差的9.9%，累積貢獻總方差的81.4%，在PCA 得分圖中，新、陳兩類稻谷有一定的聚類趨勢，但有個別樣品出現重疊的現象。為進一步提高模型的分類效能，在PCA 模型的基礎上進行有監督的OPLS-DA 分析，結果如圖3B 所示，新、陳稻谷可顯著區分為兩類。本次分析中的自變量擬合指數（R2X）為0.852，因變量擬合指數（R2Y）為0.824，模型預測指數（Q2）為0.774， R2 和Q2 大于0.5 表示模型擬合結果可接受。經過200 次置換檢驗，如圖3C 所示， R2 截距值為0.208（lt;0.30）， Q2 截距值為?0.469（lt;0.05），說明此模型不存在過擬合現象，具有良好的預測能力，可通過此模型實現新、陳稻谷鑒別。

2.4 新陳稻谷中差異化合物的篩選

為進一步篩選新、陳稻谷中的特征差異化合物，采用降維算法對數據進行VIP， VIP 值可以衡量各揮發性成分積累差異對樣本分類判別的影響強度和解釋能力， VIP 值越大表明該變量在新、陳稻谷中差異越顯著[23]。新、陳稻谷中揮發性化合物的VIP 得分圖如圖4 所示，基于OPLS-DA 模型的VIPgt;1 與plt;0.05 相結合的原則，共篩選出12 種差異化合物（紅色柱），包括4 種醇類化合物、3 種酸類化合物、3 種醛類化合物、1 種酯類化合物和1 種呋喃化合物，化合物信息列于表2。一些醇類具有相對較低的氣味閾值，對稻谷儲藏過程中的呈香起到了促進作用，其中， 1-己醇和（E，7R，11R）-3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇（植物醇）均賦予稻谷果香和花香味。在4 種醇類化合物中， 1-辛醇受儲藏時間的影響相對較小，在儲藏過程中的含量較穩定。醛類主要由不飽和脂肪酸氧化產生，苯甲醛可通過苯丙氨酸降解產生，通常具有堅果味和苦味[24]；壬醛和己醛為正鏈烷醛，具有花香和植物芳香，但高濃度的醛類會產生不好的氣味。2-戊基呋喃是由油酸和亞油酸氧化而成，具有豆香、果香和花香味。酸類和酯類通常具有較高的閾值，對稻谷的風味貢獻相對較低[25]。對12 種差異化合物的相對含量進行分析，結果表明，除植物醇在新稻谷中的含量高于陳稻谷，其余11 種化合物（包括1-己醇、2-乙基-1-己醇、1-辛醇、己酸和苯甲醛等）在陳稻谷中的含量均高于新稻谷，表明在稻谷儲藏過程中上述化合物隨著內部代謝活動產生，并導致稻谷產生苦味和酸味。

3 結論

基于揮發性成分和多元統計分析建立了儲藏稻谷新陳度的分析方法，采用HS-SPME-GC-MS/MS 技術對2019～2023 年收獲稻谷樣品中的揮發性成分進行分析，共鑒定出44 種揮發性化合物，包括醛類、醇類、酮類、酸類、酯類、酚類和呋喃類。依據化合物的特征前級離子信息建立稻谷揮發性成分的SIM分析方法，采用內標法計算化合物相對含量并進行多元統計分析。通過OPLS-DA 可以將新、陳稻谷有效區分，構建的模型不存在過擬合現象并且具有良好的預測能力。結合OPLS-DA 模型的VIPgt;1 與單因素分析plt;0.05 的原則篩選出12 種差異化合物。本研究為糧食安全領域的稻谷新陳度鑒別模型的構建提供了參考。

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