扶正軟堅抗癌方調控Akt/MDM2/P53信號通路對肝癌HepG2細胞惡性生物學行為的影響

［摘 要］ 目的：探討扶正軟堅抗癌方調控蛋白激酶B（Akt）/鼠雙微體2（MDM2）/P53信號通路對肝癌 HepG2細胞惡性生物學行為的影響。方法：采用 0、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、1. 60、3. 20 和6. 40 g·mL－1 扶正軟堅抗癌方分別處理HepG2 細胞48 h， CCK-8 法檢測HepG2 細胞存活率，篩選扶正軟堅抗癌方濃度用于后續實驗。將HepG2 細胞分為對照組、低劑量扶正軟堅抗癌方組（0. 2 g·mL－1）、中劑量扶正軟堅抗癌方組（0. 4 g·mL－1）、高劑量扶正軟堅抗癌方組（0. 8 g·mL－1）、SC79 組（8 mg·L－ 1 SC79） 和高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組（0. 8 g·mL－ 1 扶正軟堅抗癌方+8 mg·L－1 SC79）。CCK-8 法檢測各組HepG2 細胞增殖活性，克隆形成實驗檢測各組HepG2 細胞克隆形成率，流式細胞術檢測各組HepG2 細胞凋亡率，Transwell 小室實驗檢測各組HepG2 細胞遷移和侵襲細胞數，Western blotting 法檢測各組HepG2 細胞中增殖細胞核抗原（PCNA）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3 （Caspase-3）、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、磷酸化Akt （p-Akt）、磷酸化MDM2（p-MDM2） 和P53蛋白表達水平。結果：隨著扶正軟堅抗癌方濃度 （0、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、1. 60、3. 20 和6. 40 g·mL－1） 的升高， HepG2 細胞存活率逐漸降低（Plt;0. 05）， 選取0. 2、0. 4 和0. 8 g·mL－1 扶正軟堅抗癌方用于后續實驗。CCK-8 法檢測，與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細胞增殖活性均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05）；與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05）。克隆形成實驗檢測，與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細胞克隆形成率均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細胞克隆形成率明顯升高（Plt;0. 05）；與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細胞克隆形成率明顯升高（Plt;0. 05）。流式細胞術檢測，與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細胞凋亡率均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）；與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）。Transwell 小室實驗檢測，與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細胞遷移和侵襲細胞數均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2細胞遷移和侵襲細胞數均明顯升高（Plt;0. 05）；與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細胞遷移和侵襲細胞數均明顯升高（Plt;0. 05）。Western blotting 法檢測，與對照組比較， 低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p-Akt 和p-MDM2 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性；Caspase-3 和P53 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性；SC79 組HepG2 細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p-Akt 和p-MDM2 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）， Caspase-3 和P53 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）； 與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較， 高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p-Akt 和p-MDM2 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05），Caspase-3 和P53 蛋白表達水平均明顯降低 （Plt;0. 05）。結論：扶正軟堅抗癌方抑制HepG2細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡，其作用機制與抑制Akt/MDM2 信號通路、上調P53 蛋白表達有關。

［關鍵詞］ 扶正軟堅抗癌方； 蛋白激酶B； 鼠雙微體2； P53； 肝腫瘤； 細胞增殖； 細胞凋亡

［中圖分類號］ R735. 7 ［文獻標志碼］ A

肝細胞癌作為原發性肝癌的主要組織學類型，嚴重危害人們的健康［1］。大部分住院患者在診斷時已達到中晚期或不符合手術條件，因此手術切除是20%～30% 患者的首選治療方法［2］。此外，肝癌發病機制復雜，對臨床常用療法不敏感。即使是一線化療藥物聯合放療也會產生多種不良反應，包括正常組織的異常代謝和患者生活質量降低。迄今為止，尚無廣泛接受的肝癌治療方法。因此，迫切需要探索與肝癌相關的機制，并開發更有效的治療措施。扶正軟堅抗癌方由人參、黃芪、當歸、黃精、莪術、白花蛇舌草和山慈菇7 味中藥組成。其中單味藥即可抑制肝癌進展， 如黃芪能抑制磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidyqinositol-3-kinase， PI3K） /蛋白激酶B （protein kinase B，Akt） 通路發揮對肝癌細胞的抑制作用，白花蛇舌草提取物可抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡［3-4］。研究［5］ 顯示：抑制Akt/鼠雙微體2 （murine double minute 2，MDM2）通路且上調P53 蛋白表達可以抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。因此，本研究探討扶正軟堅抗癌方通過調控Akt/MDM2/P53 信號通路對肝癌細胞惡性生物學行為的影響，并闡明其作用機制。

1 材料與方法

1. 1 細胞、藥物、主要試劑和儀器 人肝癌HepG2細胞購自北京伊塔生物科技有限公司。扶正軟堅抗癌方（人參10 g、黃芪15 g、當歸10 g、黃精10 g、莪術10 g、白花蛇舌草20 g 和山慈菇10 g） 購自四川新綠色藥業科技發展股份有限公司，所有藥材加6 倍體積水浸泡1 h，加熱煎煮2 h 收集煎液， 將剩余藥渣繼續加6 倍體積水煎煮收集煎液，合并2 次煎液后低溫減壓濃縮為干浸膏，取0. 2 g 干浸膏溶解于1 mL 0. 1% 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 中， 采用0、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、1. 60、3. 20 和6. 40 g·mL－1 DMEM 培養液稀釋藥物。Akt 激活劑SC79 購自美國MCE 公司，CCK-8 試劑盒購自無錫菩禾生物醫藥技術有限公司，Annexin Ⅴ-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海富雨生物科技有限公司， 兔源一抗增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3 （cysteinyl aspartatespecific proteinase-3，Caspase-3）、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMP）-2、MMP-9、磷酸 化 Akt （phosphorylated Akt，p-Akt）、Akt、磷酸化MDM2 （phosphorylated MDM2， p-MDM2）、MDM2、 P53、 β -actin 及 辣 根 過 氧 化 物 酶（horseradish peroxidase， HRP） 標記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam 公司。SAF-680T 型酶標儀購自上海旦鼎國際貿易有限公司， CytoFLEX 型流式細胞儀購自上海貝克曼庫爾特商貿有限公司， DM6M LIBS 型光學顯微鏡購自德國徠卡公司， DYCZ-25D 型蛋白電泳儀購自北京六一儀器廠。

1. 2 細胞培養和扶正軟堅抗癌方濃度篩選 將HepG2 細胞置于含有10% 胎牛血清的DMEM 培養基中培養。取對數生長期的HepG2 細胞， 以每孔1×104 個細胞的密度接種于96 孔細胞培養板中，采用0、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、1. 60、3. 20 和6. 40 g·mL－1 扶正軟堅抗癌方分別處理HepG2 細胞48 h， 各孔中加入10 μL CCK-8 試劑，孵育2 h 后， 采用酶標儀檢測波長450 nm 處吸光度（A） 值，計算細胞存活率。細胞存活率= （實驗孔A 值－空白孔A 值）/（對照孔A 值－空白孔A 值）×100%。根據細胞存活率篩選合適的扶正軟堅抗癌方濃度用于后續實驗。

1. 3 細胞分組 取對數生長期HepG2細胞，分為對照組、低劑量扶正軟堅抗癌方組、中劑量扶正軟堅抗癌方組、高劑量扶正軟堅抗癌方組、SC79 組和高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組。低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細胞分別采用0. 2、0. 4 和0. 8 g·mL－1扶正軟堅抗癌方處理48 h，SC79 組HepG2 細胞采用8 mg·L－1 SC79 處理48 h［6］，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細胞采用0. 8 g·mL－1 扶正軟堅抗癌方和8 mg·L－1 SC79 同時處理48 h， 對照組HepG2 細胞為正常培養的HepG2 細胞，不作任何處理。

1. 4 CCK-8法檢測各組HepG2細胞增殖活性 取HepG2 細胞， 以每孔1×104 個細胞的密度接種于96 孔細胞培養板中，按照“1. 3”中細胞分組進行對應處理后，每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h，采用酶標儀檢測波長450 nm 處A 值，并計算細胞增殖活性。細胞增殖活性= （實驗孔A 值－空白孔A 值） / （對照孔A 值－ 空白孔A 值） ×100%。

1. 5 克隆形成實驗檢測各組 HepG2 細胞克隆形成率 取 HepG2 細胞，以每孔 500 個細胞的密度接種于6 孔細胞培養板中，置入細胞培養箱中培養2 周后， 甲醇固定， 0. 1% 結晶紫染色， 觀察細胞克隆形成情況，計算各組HepG2 細胞克隆形成率。克隆形成率= 形成克隆細胞數/接種總細胞數×100%。

1. 6 流式細胞術檢測各組HepG2細胞凋亡率 將“1. 3” 中培養的各組細胞用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） 洗 滌， 再 用Annexin Ⅴ -FITC/PI 染 色。37 ℃ 下 避 光 孵 育25 min 后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1. 7 Transwell小室實驗檢測各組 HepG2細胞遷移和侵襲細胞數 細胞遷移實驗：采用不含胎牛血清的DMEM 培養液調整各組HepG2 細胞密度為5×104 mL－1 ， 取200 μL 細胞懸液加入Transwell上室中，再向Transwell 下室中加入600 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培養液。37 ℃ 孵育24 h，甲醛固定， 0. 5% 結晶紫溶液染色， 光學顯微鏡下觀察各組HepG2 細胞遷移情況， 采用Image J軟件計算遷移細胞數。細胞侵襲實驗： 預先將Matrigel 基質膠涂覆于Transwell 上室， 待其自然干燥后，取上述200 μL 細胞懸液加入到Transwell上室中，剩余步驟與細胞遷移實驗一致，計算侵襲細胞數。

1. 8 Western blotting 法檢測各組 HepG2 細胞中PCNA、 Caspase-3、 MMP-2、 MMP-9、 p-Akt、p-MDM2和 P53蛋白表達水平 采用預冷的 RIPA裂解緩沖液提取HepG2 細胞總蛋白質， 將蛋白質進行定量、電泳、轉膜和封閉后，加入一抗β-actin、PCNA、Caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-Akt、Akt、p-MDM2、MDM2 和 P53 均 為 1∶ 1 000。4 ℃下孵育過夜。次日，加入二抗，于室溫下孵育1 h。ECL 試劑顯色， 采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1. 9 統計學分析 采用 SPSS 25. 0統計軟件進行統計學分析。各組HepG2 細胞增殖活性、克隆形成率、細胞凋亡率、遷移細胞數、侵襲細胞數和細胞中PCNA、Caspase-3、MMP-2 及MMP-9 蛋白和Akt/MDM2/P53 信號通路相關蛋白表達水平均符合正態分布， 以x±s 表示， 多組間樣本均數比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 不同濃度扶正軟堅抗癌方處理后HepG2細胞存活率 隨著扶正軟堅抗癌方濃度（0、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、1. 60、3. 20 和6. 40 g·mL－1）的升高， HepG2 細胞存活率（99. 93%±0. 07%、96. 88%±0. 11%、86. 88%±0. 25%、79. 83%±0. 36%、71. 26%±2. 18%、62. 59%±2. 56%、43. 15%±2. 05%、39. 26%±1. 52% 和28. 87%±1. 16%） 逐漸降低（Plt;0. 05）。0. 20、0. 40 和0. 80 g·mL－1 扶正軟堅抗癌方處理下，HepG2 細胞存活率gt;50%，因此選擇0. 20、0. 40 和0. 80 g·mL－1扶正軟堅抗癌方作為低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組。用于后續實驗。

2. 2 各組 HepG2細胞增殖活性 與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細胞增殖活性均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05）。與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05）。見表1。

2. 3 各組 HepG2 細胞克隆形成率 與對照組比較， 低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細胞克隆形成率均明顯降低（Plt;0. 05）， 并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細胞克隆形成率明顯升高（Plt;0. 05）。與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細胞克隆形成率明顯升高（Plt;0. 05）。見圖1 和表2。

2. 4 各組 HepG2 細胞凋亡率 與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細胞凋亡率均明顯降低（Plt;0. 05）， 并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）。與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）。見圖2 和表3。

2. 5 各組HepG2細胞遷移和侵襲細胞數 與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細胞遷移和侵襲細胞數均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細胞遷移和侵襲細胞數均明顯升高（Plt;0. 05）。與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較， 高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細胞遷移和侵襲細胞數均明顯升高（Plt;0. 05）。見圖3 和4 及表4。

2. 6 各組HepG2細胞中PCNA、Caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-Akt、p-MDM2和 P53蛋白表達水平 與對照組比較， 低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p-Akt和p-MDM2 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性； Caspase-3 和P53 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性；SC79 組HepG2 細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p-Akt和p-MDM2 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05），Caspase-3 和P53 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p-Akt 和p-MDM2 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 05）， Caspase-3 和P53 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖5 和表5。

3 討 論

2020 年全球癌癥統計數據［7］ 顯示： 全球每年約有90. 6 萬例肝癌新發病例和83 萬例死亡病例。肝癌起病隱匿， 攝入真菌代謝物黃曲霉毒素B1、慢性乙型或丙型肝炎病毒感染及過度飲酒均為肝癌的主要危險因素［8］。肝癌具有放療和化療干預、早期手術治療和肝移植等多種治療策略，但其5 年生存率仍低于5% ［9］。因此，需要尋找新的有效抗腫瘤藥物。中醫藥在世界范圍內被廣泛接受，主要原因是其在臨床治療和預防癌癥方面的有效性和安全性［10］。扶正軟堅抗癌方由人參、黃芪和當歸、黃精、莪術、白花蛇舌草和山慈菇7 味中藥組成。其單藥或其中幾味藥組合治療癌癥的研究較多，如人參皂苷可抑制肝癌細胞增殖［11］， 黃芪和莪術配伍可抑制肝癌裸鼠腫瘤新生血管生成［12］， 當歸多糖納米粒靶向給藥系統可有效治療肝癌并增強抗腫瘤活性［13］，山慈菇含藥血清可明顯抑制肝癌HepG2 細胞的生長，誘導細胞凋亡并抑制其上皮-間質轉化［14］。扶正軟堅抗癌方的核心藥物具有扶正和抗癌等作用。本研究結果顯示：扶正軟堅抗癌方可呈劑量依賴性地抑制HepG2 細胞增殖、遷移和侵襲， 促進細胞凋亡。此外，PCNA 是細胞異常增殖的關鍵蛋白，其表達在細胞復制過程中呈周期性變化，與細胞有絲分裂過程中DNA 含量的變化相吻合，并在細胞有絲分裂的S 期達到峰值［15］。Caspase-3 是細胞凋亡的關鍵執行蛋白，可切割對細胞活性有重要作用的蛋白質［16］。MMP-2 和MMP-9 的主要生物學功能是降解細胞外基質，參與細胞遷移和侵襲等過程［17］。本研究結果顯示： 扶正軟堅抗癌方可呈劑量依賴性地抑制HepG2 細胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達，上調Caspase-3 蛋白表達，再次從蛋白質水平上證實了扶正軟堅抗癌方對HepG2細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及其對細胞凋亡的促進作用， 提示扶正軟堅抗癌方可能成為治療肝癌的潛在有效藥物。研究［18］ 顯示：扶正抗癌方可抑制肝癌細胞增殖和轉移。扶正抑瘤湯在原發性肝癌根治切除術患者術后治療中應用效果良好，可有效地延長患者生存期，降低術后復發風險，在扶正抗癌方的基礎上，再加以軟堅（即腫瘤包塊軟化，消散結節） 之功效，為肝癌的臨床治療提供了堅實的理論基礎［19］。

Akt/MDM2/P53 信號通路失調與多種惡性腫瘤有關，Akt 磷酸化可促進轉錄因子MDM2 的穩定和核轉位，進而引發腫瘤抑制因子P53 的泛素化和降解［20］。近年來，靶向Akt/MDM2/P53 通路被認為是對抗人類惡性腫瘤的一種有效治療方式，如抑制Akt/MDM2 通路的激活且上調P53 蛋白表達可抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲［21］，抑制Akt/MDM2 通路的激活且上調P53 蛋白表達可誘導胃癌細胞凋亡［22］， 提示抑制Akt/MDM2 通路的激活且上調P53 蛋白表達可抑制腫瘤細胞的惡性進展，與本研究結果一致。本研究結果顯示： 與對照組比較，SC79 組HepG2 細胞中p-Akt 和p-MDM2 蛋白表達水平升高，P53 蛋白表達水平降低，HepG2 細胞增殖、遷移和侵襲能力增強，細胞凋亡能力減弱，證實Akt/MDM2/P53 通路參與HepG2 細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲。此外，扶正軟堅抗癌方可呈劑量依賴性地抑制HepG2 細胞中p-Akt 和p-MDM2 蛋白表達，上調P53 蛋白表達，提示扶正軟堅抗癌方可能通過調控Akt/MDM2/P53 通路抑制HepG2 細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。本研究在高劑量扶正軟堅抗癌方作用的基礎上聯合Akt 激活劑SC79 干預HepG2 細胞， 結果顯示： SC79 可減弱高劑量扶正軟堅抗癌方對HepG2 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及其對細胞凋亡的促進作用，提示扶正軟堅抗癌方可能通過抑制Akt/MDM2 通路的激活且上調P53 蛋白表達， 從而抑制HepG2 細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。

綜上所述， 扶正軟堅抗癌方可能通過抑制Akt/MDM2 通路的激活且上調P53 蛋白表達， 從而抑制HepG2 細胞增殖、遷移和侵襲， 促進細胞凋亡。本研究僅在體外細胞水平上驗證了扶正軟堅抗癌方對肝癌HepG2 細胞進展的抑制作用， 未選取不同肝癌細胞株來驗證實驗結果，本課題組后期將會進一步深入探索。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：婁靜參與研究設計、實驗操作和論文撰寫，趙雷、朱巖潔和袁帥強參與實驗操作、數據收集及整理，王菲、張杭洲、徐嬌嬌和余曉珂參與數據統計學分析及論文修改，侯留法參與實驗設計及研究指導。

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