NID1在腎透明細胞癌血管生成中的作用研究

摘要：目的 探討巢蛋白-1（NID1）在腎透明細胞癌（ccRCC）中的表達變化及對血管生成的影響。方法 利用腫瘤基因圖譜數據庫、細胞系和臨床樣本分析NID1在ccRCC中的表達，分析NID1與血管生成標志物CD31的關系。通過轉染慢病毒構建穩定敲低NID1的786-O細胞系，獲取培養上清液作為條件培養基處理人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）。HUVEC分為DMEM組、空白組、NID1空載組、NID1敲低組，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，成管實驗檢測細胞血管形成能力，劃痕實驗檢測細胞遷移能力。構建右旋糖酐水凝膠空載/敲低NID1腫瘤細胞復合物培養體系小鼠模型，分為NID1空載組和NID1敲低組，采用免疫組化染色檢測CD31表達。結果 生物信息學分析顯示ccRCC中NID1表達增高，與NID1升高呈正相關的500個差異表達基因主要富集在血管生成，且癌組織中NID1和CD31表達呈正相關。經過條件培養基處理后，與NID1空載組相比，NID1敲低組HUVEC遷移和成管能力減弱（P＜0.05），增殖能力無變化（P＞0.05）。在裸鼠模型中，與NID1空載組相比，NID1敲低組CD31表達明顯減少（P＜0.05）。結論 NID1在ccRCC中表達增高，同時對血管生成有促進作用。

關鍵詞：癌，腎細胞；細胞外基質；細胞增殖；血管新生

中圖分類號：R692.9 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240301

Role of NID1 in angiogenesis of clear cell renal cell carcinoma

SUN Chuangxin， LI Gang△

1 Department of Urology， the Second Hospital of Tianjin Medical University， Tianjin 300211， China

△Corresponding Author E-mail： 797980@sina.com

Abstract： Objective To explore the expression of nestin-1 （NID1） in clear cell renal cell carcinoma （ccRCC） and its effect on angiogenesis. Methods The expression of NID1 in ccRCC was analyzed using data from the TCGA database， cell lines and clinical samples. Additionally， the relationship between NID1 and the angiogenesis marker CD31 was investigated. A stable knockdown 786-O cell line with reduced NID1 expression was generated through lentiviral transfection. The conditioned medium obtained from these cells was used to treat human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）. HUVEC cells were divided into four groups： the DMEM group， the blank group， the NID1 empty vector group and the NID1 knockdown group. Cell proliferation ability was assessed using CCK-8 method， while tube formation ability and migration ability were evaluated through tube formation test and scratch test respectively. A mouse model of dextran hydrogel unloaded/NID1 knockdown tumor cell complex culture system was established and divided into the unloaded NID1 group and the NID1 knockdown group. Immunohistochemical staining was performed to detect the expression of CD31. Results Bioinformatics analysis revealed an increased expression of NID1 in ccRCC tissue. Furthermore， 500 differentially expressed genes positively correlated with elevated levels of NID1 were primarily enriched in angiogenesis-related processes. The results showed a positive correlation between the expression of NID1 and CD31 in cancer tissue. After treatment with conditioned medium derived from the knockdown group， HUVEC cells exhibited weakened migration and tube formation abilities in the empty vector control group （P＜0.05）， while their proliferation ability remained unchanges compared to the empty vector control group （P＞0.05）. In vivo experiments using a nude mouse model， the expression of CD31 demonstrated significantly lower levels in the NID1 knockdown group" （P＜0.05）. Conclusion The expression of NID1 is increased in ccRCC， and it can promote angiogenesis.

Key words： carcinoma， renal cell; extracellular matrix; cell proliferation; angiogenesis

腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是腎細胞癌（RCC）中最常見并且最嚴重的一種，占RCC的75%～80%［1-2］。ccRCC具有高度的血管生成能力，一些促血管生成因子，如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）在ccRCC中始終過表達，導致ccRCC中大量新生血管形成［3］。這種異常的血管生成能夠為腫瘤提供足夠的氧氣和營養物質，從而促進腫瘤的生長和進展。巢蛋白1（nidogen-1，NID1）是基底膜主要組成蛋白，能夠與層黏連蛋白-1和Ⅳ型膠原形成三元復合體，穩定基底膜網絡［4］。研究發現，在肝癌、結直腸癌、乳腺癌以及黑色素瘤等腫瘤中，NID1表達升高并且與轉移關系密切［5-7］。但是NID1在ccRCC的表達及相關功能尚不清楚。本研究通過數據庫分析、臨床樣本檢測以及體外細胞實驗和體內動物模型，旨在探討NID1在ccRCC中的表達和功能，以期為ccRCC的診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系與動物 人腎皮質近曲小管上皮細胞HK-2，人ccRCC細胞786-O、OSRC-2、769-P、CAKI-1、ACHN，人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。5只SPF級5周齡雄性BALB/c-nu小鼠（體質量18～20 g）購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2020-0004，質量合格證號110322241100244132。BALB/c-nu小鼠實驗前適應性飼養1周，溫度（22±2）℃，相對濕度60%±5%，光照條件設定為明暗各12 h循環交替，自由飲水、攝食，動物實驗經過南開大學倫理委員會批準（批準號：2023-SYDWLL-000613）。

1.1.2 臨床樣本 選取天津醫科大學第二醫院2023年9—12月收治的10例ccRCC患者的癌組織。其中男8例，女2例，年齡43～68歲，平均（59.7±7.1）歲；病理WHO/ISUP分級：Ⅰ—Ⅱ級4例、Ⅱ—Ⅲ級4例、Ⅲ級1例、Ⅲ—Ⅳ級1例。納入標準：（1）經病理學檢查確診為ccRCC。（2）均為初治患者，術前未接受放療、化療等。排除標準：（1）合并自身免疫系統疾病者。（2）合并嚴重泌尿系統疾病者。（3）臨床資料不完整者。本研究經醫院倫理委員會批準（批準編號：KY2024K244），患者及家屬簽署知情同意書。

1.1.3 主要試劑與儀器 空載（nc）和敲低（sh）NID1慢病毒購自吉凱基因；DMEM-1640培養基和胎牛血清購自上海逍鵬生物科技有限公司；胰蛋白酶、蛋白Marker、青/鏈霉素和DMSO購自賽默飛世爾科技公司；Puromycin、蛋白裂解液（RIPA）購自默克公司；CCK-8購自上海同仁化學公司；Matrigel基質膠購自康寧生命科學有限公司；ECL化學發光底物購自默克密理博公司；鼠抗人β-actin購自上海圣克魯斯生物技術有限公司；鼠抗人CD31購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗人NID1購自上海艾博抗貿易有限公司；山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；CO2恒溫培養箱、酶標儀購自賽默飛世爾科技公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳儀購自上海伯樂生命醫學產品有限公司；全自動發光成像分析儀購自上海天能科技公司。

1.2 方法

1.2.1 ccRCC生物信息學分析 在癌癥和腫瘤基因圖譜（TCGA）數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載533例ccRCC患者相關基因轉錄組數據和臨床數據，其中72例患者有癌旁組織數據。533例患者中Ⅰ期267例，Ⅱ期57例，Ⅲ期123例，Ⅳ期83例，3例分期信息缺失；無淋巴結轉移422例，有淋巴結轉移79例，32例淋巴結轉移信息缺失。使用RStudio對數據進行整理，提取并計算NID1基因的表達數據，使用DAVID Functional Annotation Tools在線網站（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對NID1相關差異表達基因進行生物學過程（biological process，BP）富集。

1.2.2 Western blot檢測NID1和CD31表達 提取10例ccRCC患者癌組織總蛋白和各細胞系總蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法測定各樣品蛋白質濃度，采用10%的SDS-PAGE分離蛋白并轉移到PVDF膜。含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，洗膜后根據實驗目的加入NID1（1∶1 000）、CD31（1∶5 000）、""""" β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，次日二抗（1：5 000）室溫下孵育1 h。ECL試劑顯色，多功能成像系統拍照，以β-actin為內參，Image J軟件分析目的蛋白條帶的灰度值并計算相對表達量。

1.2.3 nc/sh NID1穩定細胞系構建 將40 μL HiTransG P感染液、50 μL nc/sh NID1基因慢病毒加入已在6孔板中貼壁且融合度約為30%的786-O細胞中，培養72 h后進行傳代，并用含3 000 μg/L Puromycin的完全培養基進行藥物篩選。待未感染病毒的細胞全部死亡，而感染病毒的細胞再無死亡后，對細胞進行傳代處理。之后提取ncNID1 786-O、shNID1 786-O細胞蛋白并檢測NID1敲低效率。

1.2.4 條件培養基收集和分組 取正常培養、ncNID1 786-O、shNID1 786-O細胞，使用DMEM基礎培養基饑餓處理24 h后收集上清液作為條件培養基并檢測NID1表達。HUVEC分為4組：DMEM組、空白組（正常培養的786-O細胞上清液）、NID1空載組（ncNID1 786-O細胞上清液）、NID1敲低組（shNID1 786-O細胞上清液），并進行相應處理。

1.2.5 CCK-8法檢測HUVEC活性 96孔板每孔接種約1×104個HUVEC，每組3個復孔，每孔使用100 μL不同條件培養基處理24 h，隨后加入10 μL的CCK-8試劑，并置于37 ℃的恒溫培養箱中孵育2 h，多功能酶標儀測定各孔450 nm波長處光密度（OD）值。

1.2.6 劃痕實驗檢測HUVEC遷移能力 HUVEC傳代后接種于12孔板，接種密度為2×105個/孔。培養24 h后，用1 mL槍頭在孔中央劃出1條直線，將劃痕中細胞沖洗掉，于顯微鏡下采集細胞圖像，用Image J軟件定量各組劃痕面積并記為S1，然后分組處理細胞24 h，再次測量各組劃痕面積并記為S2，計算各組細胞遷移愈合率。遷移愈合率=（S1-S2）/S1×100%。

1.2.7 成管實驗檢測HUVEC血管形成能力 將胰酶消化后的HUVEC重懸計數，吸取50 μL含3×104個細胞與100 μL不同條件培養基混合，將50 μL細胞懸液加入到基質膠中，設置3個復孔。在細胞培養箱中放置4 h后取出，在鏡下觀察拍照并計數成管數。

1.2.8 水凝膠復合體系裸鼠模型構建及標本采集 ncNID1 786-O、shNID1 786-O細胞傳代后計數，并配制25 μL含1×107個細胞的細胞懸液，與125 μL右旋糖酐水凝膠復合物混合，將其注射至5只BALB/c小鼠背側皮下。小鼠左側注射ncNID1 786-O復合物（NID1空載組），右側注射shNID1 786-O復合物（NID1敲低組），注射后觸摸到小鼠背側皮下有黃豆大小堅硬腫塊即表示模型構建成功。繼續喂養小鼠21 d后，頸椎脫臼處死小鼠，剪開背側皮膚，小心剝離出凝膠組織塊，用PBS清洗并拍照，之后放入4%多聚甲醛中。

1.2.9 免疫組化染色檢測凝膠組織塊中CD31表達 將多聚甲醛中固定48 h的標本石蠟包埋，制備切片（4 μm），脫蠟后免疫組化染色CD31，脫水封片后在電子顯微鏡下觀察染色情況并拍照計數。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0進行數據分析。計量資料以[[x] ±s

]表示，2組間采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法，相關性分析采用Pearson法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NID1在ccRCC組織和細胞中的表達 數據庫分析結果顯示，與癌旁組織相比，ccRCC癌組織中NID1表達增高（52.62±45.01 vs. 149.50±108.00，t=7.519，P＜0.01）。在不同分期（Ⅰ期156.12±102.68，Ⅱ期127.65±92.76，Ⅲ期144.72±97.50，Ⅳ期150.59±144.48，F=1.195）和有無淋巴結轉移患者（149.38±144.98 vs. 150.66±99.31，t=0.097）中NID1表達差異均無統計學意義（P＞0.05）。細胞NID1檢測結果顯示，與HK-2細胞相比，ACHN、786-O、CAKI-1、OSRC-2腎癌細胞系中NID1表達均增高，其中786-O細胞中表達最高，見圖1，選取786-O細胞進行后續實驗。

]

2.2 NID1在ccRCC中的主要功能 通過對ccRCC中與NID1表達升高相關性最強的500個差異基因（Cor＞0.5，P＜0.05）進行富集，顯示這些基因的生物學功能主要富集在血管生成，見圖2A。Western blot結果顯示，臨床標本癌組織中NID1與血管生成標志物CD31表達呈正相關（r=0.706，P＜0.05），見圖2B、C。

2.3 786-O細胞中NID1轉染效率驗證 shNID1 786-O組細胞中NID1表達明顯低于ncNID1 786-O組（0.31±0.06 vs. 1.10±0.07，t=14.310，P＜0.01）。相較于正常培養組（0.80±0.06）和ncNID1 786-O組（0.81±0.07），shNID1 786-O組（0.34±0.01）細胞上清液中NID1分泌明顯減少（n=3，F=75.380，P＜0.01），見圖3。

2.4 敲低NID1表達對HUVEC增殖、成管和遷移能力的影響 CCK-8結果顯示，4組細胞增殖能力差異無統計學意義。與DMEM相比，空白組和NID1空載組HUVEC形成血管數目增多，遷移愈合率升高（P＜0.05）；與NID1空載組相比，NID1敲低組形成血管數目減少，遷移愈合率下降（P＜0.05），見表1，圖4、5。

2.5 NID1表達對裸鼠體內血管生成的影響 模型動物組織標本CD31免疫組化染色結果顯示，NID1敲低組較NID1空載組CD31陽性細胞數明顯減少（個/視野：105.20±60.03 vs. 227.80±62.21，n=5，t=3.171，P＜0.05），敲低NID1后血管生成減少，見圖6。

3 討論

ccRCC具有高度的血管生成能力，在大多數ccRCC中，抑癌基因VHL經常發生突變或缺失［8］。VHL可作為E3泛素連接酶復合物的識別組分，負責低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）的識別，通過用泛素標記蛋白質來靶向蛋白質進行蛋白酶體降解［9-10］。VHL蛋白異常或缺失會導致HIF-1降解減少，表達水平增高，使其下游基因，如VEGF、PDGF等蛋白的表達增加，從而產生大量的新生血管［11］。而腫瘤血管生成是腫瘤細胞持續存活和發育所必需的，在其生長、侵襲和轉移中起著重要作用［12-13］。因此，除了針對早期ccRCC的手術治療外，抗血管生成治療已成為了晚期和復發轉移性ccRCC患者的有效治療手段［14］。靶向血管生成的治療藥物，特別是酪氨酸激酶抑制劑（TKI），如舒尼替尼和帕唑帕尼能夠改善患者預后，已成為轉移性ccRCC的一線治療藥物［15］。但是對TKI的耐藥在臨床上很常見，特別是在長期治療后。其耐藥機制可能與促血管生成信號通路、腫瘤微環境改變有關［16］。因此找到新的治療靶點或許能夠提高ccRCC的治療效果。

NID1是基底膜的重要組成部分，主要是維持基底膜的穩定和細胞的正常生長［17］。NID1還能夠與層黏連蛋白、膠原蛋白、蛋白聚糖和細胞表面受體相互連接，控制細胞極化、遷移和侵襲［7］。有報道稱NID1可通過靶向肌球蛋白-10降低內皮細胞與細胞外基質的黏附，增強內皮細胞的遷移和血管形成能力［18］。另有研究發現，NID1表達異常與腫瘤發生發展關系密切，高表達的NID1能夠通過提高肝細胞癌［5］和唾液腺樣囊性癌［19］細胞的遷移和侵襲能力，從而促進腫瘤的轉移。本研究結果顯示，NID1在ccRCC中表達增高，但是與轉移和分期關系不大，主要與血管新生功能有關。動物模型結果也顯示，沉默NID1能夠抑制體內的血管形成。新生的血管主要是由內皮細胞增殖和遷移形成［20］。本研究細胞結果顯示，沉默NID1可以抑制HUVEC的遷移和成管，但是對其增殖能力沒有影響。因此筆者推測，NID1對ccRCC血管生成的促進作用可能是通過增強血管內皮細胞的遷移來實現的。

綜上所述，NID1在ccRCC中表達升高，能夠促進ccRCC中的血管形成，其機制可能與改變血管內皮細胞的遷移能力有關。本研究為NID1在ccRCC的表達和血管新生中的影響提供了理論基礎和實驗依據。但是本研究僅通過體內體外實驗驗證了NID1對ccRCC血管生成的促進作用，具體的作用機制尚不清楚，還需要進一步研究。

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（2024-03-12收稿 2024-06-13修回）

（本文編輯 胡小寧）

基金項目：天津市自然科學基金項目（21JCYBJCO1690）

作者單位：天津醫科大學第二醫院泌尿外科（郵編300211）

作者簡介：孫創新（1996），男，碩士在讀，主要從事泌尿外科方面研究。E-mail：sunchuangxin@tmu.edu.cn

△通信作者 E-mail：797980@sina.com

細胞與分子生物學