異甘草素緩解胺碘酮誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的實驗研究

Experimental study on the alleviation of amiodarone induced damage to human umbilical vein endothelial cells by isoliquiritigenin

Abstract" Objective：The aim of this study was to observe the protective effect of isoliquiritigenin（ISL） on damaged human umbilical vein endothelial cells（HUVECs） induced by amiodarone（AM）?induced venous inflammation.Methods：HUVECs were divided into three groups：control group，AM group（treated with AM at a concentration of 30 μmol/L for 24 h），and ISL group（pretreated with ISL at a concentration of 10 μmol/L for 1 h followed by AM at a concentration of 30 μmol/L treatment for 24 h）.The CCK?8 assay was used to determine the effective concentration of ISL.The scratch assay was performed to evaluate cell migration ability.Flow cytometry was used to assess cell apoptosis.Polymerase chain reaction（PCR） was conducted to detect the expression of proliferation factor PCNA and apoptotic factor Casepase?3.The expression of inflammatory factors tumor necrosis factor?α（TNF?α） and interleukin?6（IL?6），and adhesion factors intercellular cell adhesion molecule?1（ICAM?1） and vascular cell adhesion molecule?1（VCAM?1） were measured.Protein levels of ICAM?1 and VCAM?1 were detected using Western Blot.Results：Compared with the AM group，ISL pretreatment promoted cell proliferation and migration，inhibited cell apoptosis，and downregulated related inflammatory factors.Conclusion：ISL shows promising application prospects in preventing and treating clinical venous inflammation，and can be considered as a potential therapeutic drug for preventing venous inflammation.

Keywords" amiodarone； endothelial cells； isoliquiritigenin； venous inflammation； inflammatory factors； experimental study

摘要" 目的：通過胺碘酮誘導靜脈炎，觀察異甘草素對受損的人臍靜脈內皮細胞的保護作用。方法：將人臍靜脈內皮細胞分為空白對照組、胺碘酮組（胺碘酮30 μmol/L處理24 h）、異甘草素組（異甘草素10 μmol/L預處理1 h后胺碘酮30 μmol/L處理24 h）3組。采用細胞計數試劑（CCK?8）法確定異甘草素作用濃度，劃痕實驗觀察細胞遷移能力，流式細胞術檢測細胞凋亡程度，聚合酶鏈式反應（PCR）檢測增殖因子增殖細胞核抗原（PCNA）、凋亡因子Casepase?3、炎癥因子腫瘤壞死因子（TNF?α）、白細胞介素?6（IL?6）、黏附因子細胞間黏附分子?1（ICAM?1）和血管細胞黏附因子?1（VCAM?1）的表達；蛋白質免疫印跡法檢測黏附因子ICAM?1和VCAM?1蛋白表達。結果：與胺碘酮組比較，異甘草素預處理可促進細胞增殖和遷移，抑制細胞凋亡，下調相關炎癥因子表達。結論：異甘草素在預防和治療臨床靜脈炎方面有很好的應用前景，可作為一種潛在的預防靜脈炎的治療藥物。

關鍵詞" 胺碘酮；內皮細胞；異甘草素；靜脈炎；炎癥因子；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1009-6493.2024.23.006

研究顯示，全球80%的住院病人需要接受靜脈輸液治療，靜脈炎成為最常見的并發癥，其典型癥狀包括靜脈條索狀改變，周圍皮膚紅、腫、熱、痛，嚴重情況下可導致皮膚壞死[1]。靜脈炎的發生可能由藥物或非藥物因素引起[2]，而病人的年齡不受限制，該并發癥會增加病人的不適感，延長住院時間，并且浪費醫療資源[3]。目前，藥物引發的靜脈炎發病機制尚不明確，缺乏有效的科學護理和預防措施。胺碘酮（amiodarone）是常用的抗心律失常藥物，通過外周靜脈注射胺碘酮可導致靜脈炎的發生率高達8.0%～54.5%[3]。研究表明，胺碘酮會抑制人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的增殖，增加炎癥因子的釋放，促進細胞凋亡，從而導致血管壁受損[4]。異甘草素（isoliquiritigenin，ISL）是一種從甘草根中提取的類黃酮化合物[5]，其具有多種生物活性，如抗炎[6]、抗氧化應激[7]、抗癌[8]及保護神經[9]等。研究表明，異甘草素在多種炎癥疾病模型中具有抗炎作用，如巨噬細胞誘導的神經炎癥模型[10]、脂多糖誘導的炎癥[7]及膜性腎小球腎炎模型[11]等。然而，在護理研究領域，靜脈炎的護理預防和治療缺乏深入的分子層面研究。因此，本研究主張中西醫結合護理，利用胺碘酮誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的體外靜脈炎模型，分析異甘草素干預后人臍靜脈內皮細胞表型的變化以及炎癥因子、黏附因子等表達的變化，旨在探討異甘草素與胺碘酮引發靜脈炎的關系，并為臨床靜脈炎的預防和治療提供基于分子層面的護理思路和方向。

1" 材料和方法

1.1 使用試劑

人臍靜脈內皮細胞（購于上海生命科學研究所細胞資源中心）；胎牛血清（FBS）、青霉素混合物、胰蛋白酶、AnnexinFITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京SOLEBO公司）；細胞計數試劑（cell counting kit?8，CCK?8）、異甘草素（美國MCE公司）；胺碘酮（上海賽諾菲公司）；兔抗增殖相關因子（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Casepase?3、山羊抗兔二抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；一抗黏附因子細胞間黏附分子?1（intercellular cell adhesion molecule?1，ICAM?1）和血管細胞黏附因子?1（vascular cell adhesion molecule?1，VCAM?1）（沈陽萬科生物科技有限公司）；核蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物有限公司）；Trizol試劑盒、TB Green?Premix Ex Taq? Ⅱ（日本Takara公司）；PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酵生物科技公司）；PVDF膜（美國milliPore公司）蛋白Maker（聚合美）；DMEMI640培養基（美國Hyclone公司）。

1.2 細胞培養

在含10%的胎牛血清和1%的青霉素鏈霉素混合物的DMEM培養基中培養，置于二氧化碳培養箱（37 ℃，5%二氧化碳）。空白對照組：不予干預；胺碘酮組：胺碘酮30 μmol/L處理24 h（按說明書制備）；異甘草素組：10 μmol/L異甘草素預處理1 h后，胺碘酮30 μmol/L處理24 h。課題組對胺碘酮對人臍靜脈內皮細胞損傷的濃度和時間進行了初步研究[4]，本研究在此基礎上繼續探討異甘草素的保護作用。

1.3 細胞活力的測定

1.3.1 確定異甘草素對人臍靜脈內皮細胞無毒作用的最佳濃度

將人臍靜脈內皮細胞以每孔1×104接種在96孔板中，設置異甘草素濃度梯度，終止培養后，每孔加入10 μL CCK?8試劑，孵育2 h，使用酶標儀檢測各組吸光度值（450 nm波長），吸光度值=各孔OD值-調零孔OD值。分別檢測12、24 h吸光度值。

1.3.2 確定異甘草素對胺碘酮誘導的人臍靜脈內皮細胞保護的最佳濃度

取上述對正常細胞無害的異甘草素濃度，先預處理1 h后加入胺碘酮（30 μmol/L）處理24 h，重復上述方法檢測OD值。

1.4 劃痕實驗

提前用Marker筆在6孔板各孔背后畫5條平行線，將人臍靜脈內皮細胞均勻接種在6孔板中，分為空白對照組、胺碘酮組和異甘草素組。在各孔中使用10 μL無菌槍頭垂直之前的平行線劃線，形成劃痕。3組細胞用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）緩慢沖洗2次，再加入無血清培養基，共培養12、24 h。使用Image J8.0分析0、12、24 h的劃痕面積。

1.5 流式細胞凋亡實驗

將人臍靜脈內皮細胞均勻接種在6孔板中，將細胞分為空白對照組、胺碘酮組和異甘草素預處理組。用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化細胞，置于1.5 mL Ep管中，用4 ℃預冷的PBS洗滌2次。收集1×105的細胞并置于流式管中，每管加入100 μL的Binding Buffer重懸細胞；然后加入5 μL AnnexinV FITC，在室溫下用錫紙暗孵育5 min，然后在每管中加入5 μL碘比丙啶溶液（PI），在流式細胞儀上測試。

1.6 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）

將各組細胞使用Trizol試劑提取細胞總核糖核酸（RNA），用紫外分光光度計檢測D260/D280值。根據逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為互補于mRNA的DNA分子（cDNA），甘油醛?3?磷酸脫氫酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為聚合酶鏈式反應擴增的內參。用2-T△△CT計算相對信使RNA（mRNA）量。引物序列見表1。

1.7 蛋白質免疫印跡法（Western Blot）

使用全蛋白試劑盒從各組細胞中提取總蛋白，并采用二喹啉甲酸法（BCA）試劑盒測定蛋白濃度，對蛋白進行變形處理。配膠后加入蛋白樣品，進行SDS‐PAGE凝膠電泳、轉膜，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，隨后加入一抗（β?actin 1∶4 500，PCNA 1∶1 000，Casepase?3 1∶1 000，ICAM?1 1∶1 000，VCAM?1 1∶5 000），4 ℃過夜。次日TBST洗膜3次，加入羊抗兔IgG二抗（1∶8 000），孵育1 h，再次洗膜后采用電化學發光法（ECL）試劑盒顯色。

1.8 統計學分析

通過SPSS 26.0統計軟件分析數據，所有數據均為符合正態分布的定量資料，以均數±標準差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組數據之間比較采用單因素方差分析。實驗中的連續型變量采用重復測量方差分析。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1 異甘草素預處理增加胺碘酮所致靜脈炎細胞活力，恢復受損細胞形態

采用CCK?8法分別檢測12 h和24 h異甘草素細胞活力，結果表明，12 h不同濃度異甘草素（0～100 μmol/L）及24 h異甘草素濃度0～20 μmol/L對人臍靜脈內皮細胞均無明顯損傷（均Pgt;0.05），詳見圖1、圖2。因此選擇異甘草素（0～20 μmol/L）作為人臍靜脈內皮細胞無毒性作用濃度展開后續實驗。再次采用CCK?8法檢測使用異甘草素（0～20 μmol/L）預處理1 h后用胺碘酮處理人臍靜脈內皮細胞后細胞活力，尋找異甘草素最佳作用濃度。結果表明，當異甘草素組所取的濃度為10 μmol/L時，細胞活力明顯上升，顯著增高為94.9%，差異有統計學意義（Plt;0.05）。因此，選用異甘草素（10 μmol/L，1 h）預處理，胺碘酮（30 μmol/L，24 h）作為本研究的異甘草素組。詳見圖3。

2.2 異甘草素增強胺碘酮誘導人臍靜脈內皮細胞遷移能力，促進細胞增殖

采用劃痕實驗觀察不同時間細胞的愈合情況，12 h各組細胞劃痕面積與0 h相比，胺碘酮組抑制人臍靜脈內皮細胞的遷移，而異甘草素組促進了人臍靜脈內皮細胞的遷移，隨著時間增加，24 h各組細胞劃痕面積在顯微鏡下可更明顯觀察到結果，發現異甘草素預處理可以提高胺碘酮誘導的人臍靜脈內皮細胞的遷移能力。同時還采用RT?PCR實驗檢測PCNA的蛋白表達，進一步驗證異甘草素對胺碘酮誘導的人臍靜脈內皮細胞遷移能力。結果顯示，胺碘酮組下調了PCNA蛋白的表達，而異甘草素組PCNA的表達顯著增高，差異有統計學意義（Plt;0.05），詳見表2。因此，本研究發現異甘草素可以促進胺碘酮誘導人臍靜脈內皮細胞的增殖，從而促進細胞的愈合。

2.3 異甘草素減輕胺碘酮誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡

采用流式細胞術觀察細胞凋亡情況，Annexin V FITC/PI實驗顯示，空白對照組凋亡率為（4.10±0.26）%，胺碘酮組為（17.82±0.36）%，而異甘草素組凋亡率下降至（11.31±0.45）%，差異有統計學意義（Plt;0.05），表明異甘草素可以減少胺碘酮誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡。此外，采用RT?PCR法檢測Casepase?3蛋白的表達，胺碘酮組與空白對照組比較，Casepase?3的蛋白表達明顯增加，異甘草素組與胺碘酮組比較，凋亡相關蛋白的表達明顯減少，差異均有統計學意義（Plt;0.05），詳見表3。因此，在基因和蛋白水平上，進一步證明異甘草素可以降低胺碘酮誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡。

2.4 異甘草素對胺碘酮誘導人臍靜脈內皮細胞具有抗炎作用

采用聚合酶鏈式反應實驗檢測各組炎癥因子：腫瘤壞死因子、白細胞介素?6及黏附因子ICAM?1、VCAM?1逆轉錄酶mRNA表達結果，發現胺碘酮組與空白對照組比較，炎癥因子及黏附因子的表達量明顯升高，而異甘草素組的表達量有所下降，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。詳見表4。蛋白免疫印跡法檢測黏附因子（ICAM?1、VCAM?1）蛋白表達，胺碘酮組與空白對照組比較，人臍靜脈內皮細胞中蛋白表達顯著增加，差異有統計學意義（Plt;0.05），經過異甘草素預處理后，細胞中的蛋白表達下降，差異有統計學意義（Plt;0.05），提示異甘草素具有抗炎性活性，可以保護胺碘酮對細胞的抑制作用。詳見圖4、圖5、表5。

3" 討論

靜脈炎的本質是血管內膜發生炎癥，其炎癥體征均由血管內皮細胞通過局部血管屏障功能變化介導[12]。病理機制分為血管內皮損傷、白細胞黏附、白細胞遷移、炎癥反應、組織損傷及修復五大步驟[13]。當血管受到機械或化學物質刺激、細菌或其他微生物感染時，靜脈內壁上的血管內皮細胞會受損[14]。在細胞損傷處，內皮細胞將釋放炎癥介質、細胞因子和趨化因子。伴隨著炎癥介質的釋放，選擇素、整合素和黏附分子會促使白細胞，尤其是中性粒細胞黏附于內皮細胞表面。之后，內皮細胞會進一步釋放趨化因子，吸引附近的白細胞向炎癥部位遷移，并穿過血管內皮間隙進入靜脈壁組織。細胞蛋白質介導的靜脈內炎癥反應和受損組織自我修復過程也會發生。輸注胺碘酮的病人常常會出現靜脈周圍紅、腫、熱等損傷，這可能與藥物自身性質相關。胺碘酮pH值為4.7，是刺激性藥物，含有碘成分，輸液時可能產生沉積從而刺激血管壁，引起炎癥。本研究發現，相對于胺碘酮組，異甘草素組人臍靜脈內皮細胞的細胞活力增加，遷移能力增強，促炎因子、凋亡基因和蛋白表達減少。這說明護士需掌握輸注藥物的理化性質，預防輸液過程中靜脈炎的發生。

劃痕實驗是模擬“傷口”形狀，在細胞表面劃線形成劃痕，然后觀察細胞愈合能力的實驗方法。本研究發現，相比胺碘酮組，異甘草素組顯著提高了胺碘酮誘導的人臍靜脈內皮細胞的遷移能力，這一結果與以前的研究結果[4]一致。流式細胞術是一種用于對細胞進行多參數高速分析和定量分選的技術。細胞凋亡也稱程序性細胞死亡，是疾病發生的早期預警信號，可以通過內皮細胞調節炎癥平衡維持機體內環境的穩定[15?16]。研究指出，血管緊張素誘導高血壓和動脈粥樣硬化都是通過誘導內皮細胞凋亡引起內皮功能障礙和炎癥[17?18]。本研究中，胺碘酮組細胞凋亡率、相關基因和蛋白表達最高，經過異甘草素預處理后可以減少細胞凋亡，表明胺碘酮破壞了機體穩定的環境，加速了內皮細胞受損，而異甘草素具有抑制內皮細胞凋亡的保護作用。此外，本研究還檢測了一些炎癥因子和黏附因子的基因和蛋白的表達量，因為ICAM?1和VCAM?1介導白細胞的黏附和外滲，在炎癥反應中發揮關鍵作用[19]，研究證實多種細胞因子通過核轉錄因子?κB（NF?κB）信號通路上調ICAM?1的表達[20]及抑制黏附因子的表達治療炎癥疾病[21]。之前的靜脈炎相關研究僅檢測了炎癥因子，本研究進一步關注黏附分子的變化，在靜脈炎的病理改變過程中探索相關細胞因子以進行多方面驗證。

目前，關于藥物引起靜脈炎的原因主要包括輸注藥物濃度、藥物的理化性質、輸液時間、輸液量和輸液速度。然而，針對靜脈炎的防治措施尚未有公認和明確的特效方法，常用的方法主要分為物理治療和藥物治療兩大類[22]。相關指南建議，可以采用經外周靜脈穿刺中心靜脈置管（PICC）的方法來預防因化療藥物引起的靜脈炎[23]，但由于輸注胺碘酮時大多為緊急情況，沒有充足時間完成置管操作，同時考慮病人經濟的影響，他們可能不愿意選擇這種輸液方式，因此亟須解決非化療藥物外周輸注時引起的靜脈炎問題。目前大多數學者通過甘露醇誘導靜脈炎的動物模型進行研究[24?25]。莊惠人等[26]利用胺碘酮誘導靜脈炎的動物模型，發現酚妥拉明加林可霉素利多卡因凝膠治療效果優于硫酸鎂濕敷。研究表明，中藥具有抗炎作用[27?28]，尤其異甘草素在治療炎癥性疾病方面有積極作用，異甘草素可以通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC?1α）/核因子E2相關因子2（Nrf2）通路提高抗氧化應激能力，減輕炎癥反應和細胞凋亡，抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體，為急性肝損傷的治療提供了新思路[29]。此外，在研究盲腸結扎穿刺法（CLP）引起的膿毒癥小鼠腦損傷過程中，研究人員發現異甘草素可以通過抑制NF?κB信號通路的激活減輕炎癥反應的發生[30]。與上述研究相比，本研究僅從表型上探究了異甘草素的相關作用，并未從可能發生的機制入手。

4" 小結

本研究從基礎實驗出發，豐富了護士對靜脈炎防治機制的認識。然而，此研究的局限性在于僅進行了體外實驗的表型驗證，未對可能發生的機制進行探討，所得結論未在體內實驗中得到應用，為進一步深入研究異甘草素對兔耳靜脈炎的保護作用，并挖掘其潛在的應用價值，計劃將異甘草素附載于納米材料中制備成凝膠，以進行進一步實驗，為臨床實踐提供更準確、科學的參考。

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