毛蕊異黃酮對脊髓損傷大鼠神經元自噬及凋亡的影響

摘要：目的 探討毛蕊異黃酮（CAL）調控PI3K/Akt信號通路對脊髓損傷（SCI）大鼠神經元自噬及凋亡的影響及其作用機制。方法 32只成年SD大鼠隨機分為假手術組（Sham組），模型組（SCI組）和CAL低、高劑量組，每組8只。采用改良Allen’s法建立大鼠中度SCI模型，術后CAL低、高劑量組立即分別予以20、40 mg/kg CAL腹腔注射，1次/d，連續7 d；Sham組和SCI組給予等量生理鹽水。術后1、3和7 d，采用行為學評分（BBB）評估大鼠運動功能的恢復情況；術后7 d，尼氏染色檢測大鼠脊髓前角運動神經元存活數量，Western blot檢測p62、Beclin-1、微管相關蛋白1輕鏈3（LC3B）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和活化型胱天蛋白酶-3（Cleaved-Caspase-3）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2關聯X蛋白（Bax）表達，免疫熒光染色檢測大鼠脊髓前角神經元LC3B的表達。結果 與Sham組相比，SCI組大鼠BBB評分、神經元存活數量、Bcl-2、Bcl-2/Bax、p-PI3K、p-PI3K/PI3K、p-Akt、p-Akt/Akt水平降低，p62、Beclin-1、LC3BⅡ、LC3BⅡ/Ⅰ、Cleaved-Caspase-3、Bax水平升高（P＜0.05）；與SCI組相比，CAL低、高劑量組BBB評分、神經元存活數量、LC3BⅡ、LC3BⅡ/Ⅰ、Bcl-2、Bcl-2/Bax、p-PI3K、p-PI3K/PI3K、p-Akt、p-Akt/Akt水平升高，p62、Cleaved-Caspase-3、Bax水平降低（P＜0.05）。結論 CAL可通過激活PI3K/Akt信號通路促進SCI大鼠神經元自噬，抑制其凋亡，進而發揮神經保護作用。

關鍵詞：毛蕊異黃酮；脊髓損傷；自噬；PI3K/Akt信號通路

中圖分類號：R651.2，R285.6 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20231623

Effects of calycosin on neuronal autophagy and apoptosis in rats with spinal cord injury

LI Daqiang1， LI Jian1， LU Zheming2， CAO Yang1△

1 Department of Orthopedics， 2 Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of

Jinzhou Medical University， Jinzhou 121000， China

△Corresponding Author E-mail： cyclcmh@sina.com

Abstract： Objective To explore the effect of calycosin （CAL） on neuronal autophagy and apoptosis in rats with spinal cord injury （SCI） by regulating PI3K/Akt signaling pathway" and its mechanism. Methods A total of 32 male or female adult SD rats were randomly divided into the sham group， the SCI group， the CAL low （20 mg/kg） dose group and the CAL high （40 mg/kg） dose group with 8 rats in each group. The rat model of moderate SCI was established by modified Allen’s method. After successful modeling， rats were injected intraperitoneally immediately with different dosage of CAL or equal amount of saline once a day for 7 consecutive days. Basso， Beattie and Bresnahan （BBB） scores were used to evaluate the recovery of motor function of rats at 1， 3 and 7 d after surgery. At 7 d after surgery， Nissl staining was used to detect the surviving number of motor neurons in" anterior horn of spinal cord. Western blot assay was used to assess expression levels of p62， Beclin-1， microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3B）， phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/protein kinase B （Akt） pathway， Cleaved-Caspase-3， B-cell lymphoma-2 （Bcl-2） and Bcl-2-associated X protein （Bax） proteins. Immunofluorescence staining was used to measure the expression of LC3B in anterior neurons of spinal cord. Results Compared with the sham group， BBB scores， the surviving number of motor neurons and levels of Bcl-2， Bcl-2/Bax， p-PI3K， p-PI3K/PI3K， p-Akt and p-Akt/Akt were significantly decreased （P＜0.05）， and levels of p62， Beclin-1， LC3B Ⅱ， LC3B Ⅱ/Ⅰ， Cleaved-Caspase-3 and Bax were significantly increased in the SCI group （P＜0.05）. Compared with the SCI group， BBB scores， the survival of anterior horn motor neurons and levels of LC3B Ⅱ， LC3B Ⅱ/Ⅰ， Bcl-2， Bcl-2/Bax， p-PI3K， p-PI3K/PI3K， p-Akt and p-Akt/Akt were increased in the CAL low dose group and CAL high dose group， and levels of p62， Cleaved-Caspase-3 and Baxcould were significantly decreased" （P＜0.05）. Conclusion CAL could promote autophagy and inhibit apoptosis of neurons through activating PI3K/Akt signaling pathway， thereby conferring a protective role following SCI in rats.

Key words： calycosin; spinal cord injury; autophagy; PI3K/Akt signaling pathway

脊髓損傷（SCI）是一種嚴重的骨外科創傷疾病，通常導致患者出現損傷平面以下感覺和運動功能障礙，嚴重可致癱瘓甚至死亡［1］。神經元凋亡是造成SCI后運動功能障礙的主要原因，早期有效干預減少神經元凋亡是促進SCI后運動功能恢復的關鍵［2］。自噬在調控細胞凋亡過程中發揮著重要的作用，促進或抑制自噬均可加速神經元凋亡，這可能與SCI損傷位置、程度和時間相關［3-4］。近年來研究證實，促進大鼠中度SCI后神經元自噬可以有效緩解神經元凋亡，對治療SCI意義重大［5-6］。毛蕊異黃酮（CAL）是一種從中藥黃芪中提取的重要活性成分，具有顯著的抗炎、抗氧化應激、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理學特性［7］。大量的體內外研究發現，CAL可以有效緩解腦缺血再灌注［8-9］和出血性損傷誘導的神經功能破壞［10］，改善阿爾茨海默病（AD）［11］及帕金森病（PD）［12］引起的認知功能障礙和行為學缺損，提示其對神經系統具有較好的保護功能。此外，近期有研究報道CAL在大鼠SCI中發揮著神經保護作用［13］，然而其潛在的作用機制尚不明確。基于此，本研究擬通過建立大鼠中度SCI模型探討CAL對SCI后神經元自噬、凋亡和運動功能的影響及其可能的作用機制，以期為臨床治療SCI的藥物研發提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠32只，雌雄各半，體質量（200±20）g，由錦州醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK［遼］2019-0003，動物使用許可證號：SYXK［遼］2019-0007。大鼠均放置于恒溫（24±2）℃、恒濕50%±10%環境，自由飲水和攝食，晝夜12 h/12 h環境規律交替飼養。所有動物實驗均遵循《國家實驗動物護理和使用健康研究所指南》進行，并獲得錦州醫科大學動物倫理委員會批準（編號：20211205）。

1.1.2 主要試劑與儀器 改良后的Allen’s打擊裝置由錦州醫科大學附屬第一醫院骨科自制），CAL（純度＞98％）購自中國源葉生物科技有限公司，Beclin-1、p62、微管相關蛋白1輕鏈3（LC3B）均購自武漢三鷹生物技術有限公司，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化（p）-PI3K、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、活化型胱天蛋白酶-3（Cleaved-Caspase-3）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2關聯X蛋白（Bax）均購自江蘇親科生物有限公司，β-actin購自北京博奧森技術有限公司，山羊抗兔/鼠二抗IgG Hamp;L購自沈陽萬類生物科技有限公司，熒光山羊抗兔/鼠二抗購自美國Thermo Fisher Scientific試劑有限公司，PVDF膜（0.22/0.45 μm）購自美國Millipore公司，蛋白Marker購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司，BCA蛋白檢測試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒、尼氏染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。酶標儀、電泳和轉膜槽購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型構建 大鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法分為假手術組（Sham組），模型組（SCI組），CAL低、高劑量組，每組8只。參照改良后Allen’s打擊法［14］建立大鼠中度SCI模型：2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，滿意后，大鼠俯臥，四肢固定于手術板上，以T10節段為中心完成背部剃毛、手術區域消毒，隨后切開皮膚，咬除椎板，暴露脊髓，用自制的打擊裝置（質量20 g，高2.5 cm）垂直下落，撞擊T10段脊髓，大鼠出現擺尾，后肢抽動痙攣隨即癱瘓即表示造模成功。術后沖洗、縫合傷口。Sham組僅去除椎板，不損傷脊髓。術后CAL低、高劑量組立即分別予以20、40 mg/kg的CAL腹腔注射，1 次/d，持續7 d，連續3 d腹腔注射200 000 U青霉素預防切口感染。造模不成功或術中、術后死亡者被剔除，并按照隨機原則及時補充。Sham組與SCI組給予腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.2 行為學評分 術后1、3和7 d，每組隨機抽取6只大鼠，由單盲觀察者參照行為學Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分標準［15］對大鼠后肢進行運動功能評分，觀察最少5 min，內容主要包括髖、膝和踝關節活動度，后肢步態及協調能力，后肢小關節精細運動能力；總分21分，0分表示大鼠后肢運動功能完全癱瘓，21分表示大鼠后肢運動功能正常；評分越高表示神經功能恢復越好。每只大鼠重復評分3次，計算平均值。

1.2.3 尼氏染色 術后7 d，每組隨機抽取4只大鼠。2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）成功麻醉后，給予4%多聚甲醛溶液進行灌流，待大鼠肝臟變白，四肢及尾巴僵硬后灌流結束，提取距損傷中心上下各1.0 cm，總長約為2 cm的脊髓組織。石蠟包埋切片后脫蠟至水，樣本置于甲苯胺藍染色液內55 ℃恒溫浸染30 min，95%乙醇分化，無水乙醇脫水及二甲苯透明，中性樹膠封固后于普通光學顯微鏡下觀察拍照，檢測大鼠脊髓前角運動神經元存活數量。多余石蠟切片于-20 ℃保存備用。

1.2.4 Western blot 術后7 d，每組取4只大鼠，麻醉滿意后斷頭處死。隨后冰上快速提取距損傷中心上、下各0.5 cm，總長約為1 cm的脊髓組織，經過碾磨、定量后制備蛋白樣品。采用10%或12% SDS-PAGE，隨即轉移至0.22或0.45 μm PVDF膜。室溫快速封閉12～15 min后，依次加入p62（1∶4 000），LC3B、Beclin-1（均1∶2 000），Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt（均1∶800）和β-actin（1∶5 000），于4 ℃冰箱孵育過夜，次日0.1 mol/L TBST清洗后加入山羊抗兔/鼠二抗（均1∶5 000）室溫孵育2 h，隨后ECL顯色，Image J軟件分析目的蛋白相對表達量。

1.2.5 免疫熒光染色 取備用石蠟切片，復溫，0.1 mol/L PBS清洗后加入10%山羊血清，室溫封閉1 h，隨即加入LC3B（1∶50）和Neuron（1∶80），于4 ℃冰箱孵育過夜。次日0.1 mol/L PBS清洗后滴加熒光山羊抗兔/鼠二抗（均1∶500）濕盒內避光孵育2 h。加入DAPI染細胞核5 min后，甘油封片并于倒置熒光顯微鏡下拍照獲取圖片，檢測大鼠脊髓前角神經元LC3B的表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以[[x] ±s

]表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法；多組間不同時點比較采用重復測量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CAL促進大鼠SCI后運動功能的恢復 術后1、3和7 d，Sham組大鼠BBB評分未見明顯變化。術后1 d，與Sham組相比，SCI組和CAL低、高劑量組大鼠BBB評分降低；術后3 d和7 d，CAL低、高劑量組大鼠BBB評分較SCI組升高；術后7 d，CAL高劑量組BBB評分較CAL低劑量組升高（P＜0.05），見表1。

2.2 CAL促進大鼠SCI后前角運動神經元的存" "活 術后7 d，Sham組大鼠脊髓前角可見大量結構完整、形態規則、分布均勻的尼氏小體（37.50±2.08）；SCI組大鼠出現明顯病理學現象，包括脊髓組織破壞、尼氏小體排列紊亂及數量（12.25±3.10）丟失；與SCI組相比，CAL低、高劑量組大鼠脊髓組織損害程度減輕，尼氏小體形態緩解、數量（分別為23.25±3.30、29.50±3.51）明顯增多（P＜0.05），CAL高劑量組大鼠尼氏小體數量較CAL低劑量組增多（n=4，F=48.870，P＜0.05），見圖1。

2.3 CAL促進大鼠SCI后神經元自噬 術后7 d，與Sham組相比，SCI組大鼠脊髓組織p62、Beclin-1、LC3BⅡ蛋白表達和LC3BⅡ/Ⅰ水平升高（P＜0.05）；與SCI組相比，CAL低、高劑量組p62蛋白表達水平降低，LC3BⅡ蛋白表達和LC3BⅡ/Ⅰ水平升高，CAL高劑量組Beclin-1蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與CAL低劑量組相比，CAL高劑量組p62蛋白表達水平降低，Beclin-1、LC3BⅡ蛋白表達和LC3BⅡ/Ⅰ水平升高（P＜0.05）。正常表達的LC3B主要位于細胞漿，自噬形成時，胞漿型LC3B向細胞雙層膜遷移，呈顆粒狀和均質狀分布。Sham組大鼠前角LC3B陽性神經元數量較少，SCI后LC3B陽性神經元數量明顯增多，給予低、高劑量CAL后，LC3B陽性神經元數量進一步增多，脊髓前角神經元自噬活性增強。見表2，圖2、3。

2.4 CAL抑制大鼠SCI后神經元凋亡 術后7 d，與Sham組相比，SCI組大鼠脊髓組織Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax表達水平降低（P＜0.05）；與SCI組相比，CAL低、高劑量組大鼠Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax表達水平升高（P＜0.05）；與CAL低劑量組相比，CAL高劑量組Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax表達水平升高（P＜0.05）。見表3、圖4。

2.5 CAL促進大鼠SCI后PI3K/Akt信號通路的激活 術后7 d，與Sham組相比，SCI組大鼠脊髓組織p-PI3K、p-PI3K/PI3K、p-Akt、p-Akt/Akt蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與SCI組相比，CAL低、高劑量組大鼠脊髓組織p-PI3K、p-PI3K/PI3K、p-Akt、p-Akt/Akt蛋白表達水平升高。見表4、圖5。

3 討論

SCI是一種由多種外界因素導致的重大創傷性神經疾病，具有很高的致殘率和病死率［16］。研究發現SCI的遠期功能恢復與繼發性損傷密切相關，后者持續時間長短不一，病理機制復雜，包括水腫、神經炎癥、細胞自噬與凋亡、氧化應激等［6］。自噬作為繼發性SCI病理機制的重要表征，在脊髓繼發性損傷的發生、發展過程中發揮雙重作用，即適度的自噬可通過消化、降解功能失調的細胞和細胞器完成細胞的重建、再生和修復，為實現細胞循環提供原料，然而，過度的自噬又會加速神經細胞死亡，這些可能與損傷的部位、嚴重程度及時間有關［3-4］。多項有關中度SCI模型的研究證實，促進神經元自噬可顯著緩解脊髓組織的損傷，抑制神經元凋亡，進而改善SCI的預后［2，5-6］。因此，尋求有效的干預手段，促進神經元自噬、抑制其凋亡對治療SCI和改善神經功能缺損意義重大。

中草藥提純物具有易吸收、不良反應小、可通過脊髓和血腦屏障等優點，近年來越來越受到學者的青睞。CAL是從中藥黃芪中提取的有效活性成分之一，具有多種生物活性［7］。研究證實CAL可通過調控多種信號通路促進大鼠腦缺血再灌注損傷（CIRI）后內皮細胞的遷移和增生，緩解損傷誘導的炎癥反應和微環境的破壞［17-18］，同時可通過抑制CIRI誘導的氧化應激降低腦水腫和腦組織壞死［9］。此外，CAL在治療AD和PD中具有突出的療效。Song等［11］在轉基因小鼠AD模型中證實，腹腔注射CAL 20 mg/kg和40 mg/kg可有效抑制小膠質細胞介導的炎癥和氧化應激，緩解小鼠腦認知功能障礙。Yang等［19］通過體外實驗證實CAL可通過拮抗Toll樣受體（TLR）/核因子（NF-κB）和MAPK通路激活抑制PD誘導的腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β和IL-6等促炎因子的釋放。值得注意的是，近期有研究報道CAL可通過抑制SCI誘導的炎癥和氧化應激促進大鼠SCI后運動功能恢復，提示CAL具有潛在的神經保護作用。與以上研究相同，本研究通過改良后的Allen’s法建立大鼠中度SCI模型，結果顯示大鼠脊髓受打擊后出現明顯的運動功能缺損，表現為后肢BBB評分顯著降低，連續7 d給予CAL后，大鼠BBB評分顯著上升，且尼氏結果證實了大鼠SCI后前角運動神經元結構破壞明顯及數量顯著降低。與SCI組相比，低、高劑量的CAL可顯著緩解神經元形態結構的損壞，促進神經元存活，CAL高劑量組大鼠BBB評分和神經元存活數量顯著高于低劑量組，提示CAL對SCI大鼠的神經保護作用可能具有劑量依賴性。

為進一步明確CAL是否通過介導SCI誘導神經元自噬來發揮神經保護作用，本研究檢測了Beclin-1、LC3B和p62等自噬相關蛋白的表達，結果顯示，與Sham組比較，SCI組脊髓組織內Beclin-1、LC3BⅡ、p62蛋白表達和LC3BⅡ/Ⅰ水平顯著升高，提示SCI誘導自噬的激活。與SCI組相比，CAL低、高劑量組Beclin-1、LC3BⅡ蛋白表達和LC3BⅡ/Ⅰ水平顯著升高，p62蛋白表達水平減低，且免疫熒光染色結果與Western blot結果一致，大鼠SCI后LC3B陽性神經元數量明顯增多，給予低、高劑量CAL后可進一步上調LC3B蛋白的表達，提示CAL可促進大鼠SCI后神經元自噬活性的增強。

Bcl-2/Bax蛋白家族在介導細胞凋亡過程中發揮著不可替代的作用，Bcl-2抑制凋亡，而Bax促進凋亡，Bcl-2/Bax比值則表示凋亡程度［20］。Cleaved-Caspase-3是另一個凋亡調控因子，其表達上調提示凋亡水平增強［21］。本研究結果顯示，大鼠SCI后，促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平顯著增高，Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax水平顯著降低；給予低、高劑量CAL后，Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax水平顯著增高，提示CAL可顯著抑制大鼠SCI后神經細胞的凋亡。PI3K/Akt通路作為介導線粒體自噬的經典信號通路之一，參與SCI后自噬激活和抗凋亡機制的調控［22］。研究證實，激活PI3K/Akt信號通路可削弱促凋亡相關下游分子（如Cleaved-Caspase-3、6、9）的表達，同時加速Bcl-2/Beclin-1復合物的分離，進而釋放更多的Beclin-1誘導神經元自噬，最終發揮神經保護作用［22-23］。有報道CAL可作為PI3K的激活劑激活PI3K/Akt通路來降低心衰導致的心肌細胞炎癥和纖維化［24］，緩解氧化應激介導的糖尿病引發的認知功能缺損［25］，以及缺血再灌注導致的腦損傷［26］，提示CAL參與了PI3K/Akt信號通路的調控。為深入探討CAL發揮抗SCI后神經元凋亡作用的可能機制，本研究采用Western blot檢測了PI3K和Akt蛋白表達，結果顯示，與Sham組相比，SCI組大鼠脊髓組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達水平顯著減低，給予低、高劑量的CAL后，p-PI3K和p-Akt蛋白表達水平顯著上升，提示CAL可促進大鼠SCI后PI3K/Akt信號通路激活。

綜上所述，CAL可有效促進大鼠SCI后神經元自噬，抑制其凋亡，進而促進神經元存活，緩解大鼠SCI后運動功能的缺損，且其作用可能呈劑量依賴性；并揭示了其潛在的作用機制可能與PI3K/Akt信號通路調控相關。本研究的不足之處在于缺少體外實驗的佐證，后續將繼續開展CAL在細胞水平的實驗，進一步深入探討其他可能的作用機制。

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（2023-11-06收稿 2024-01-25修回）

（本文編輯 陳麗潔）