黃芪甲苷通過高爾基體應(yīng)激調(diào)控高糖誘導RGC-5細胞氧化應(yīng)激、凋亡、自噬的機制研究

摘要" 目的：探究黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞氧化應(yīng)激、凋亡、自噬的影響，并探究其與高爾基體應(yīng)激之間的關(guān)系。方法：將不同濃度葡萄糖（5、35 mmol/L）處理的RGC-5細胞設(shè)為正常（NG）組、高糖（HG）組；不同濃度黃芪甲苷（20、40、60、80、100 μmol/L）處理高糖RGC-5細胞，篩選最適濃度60 μmol/L。將si-NC、si-高爾基磷蛋白3（GOLPH3）轉(zhuǎn)染至高糖和黃芪甲苷共處理的RGC-5細胞，設(shè)為黃芪甲苷＋si-NC組、黃芪甲苷＋si-GOLPH3組。細胞計數(shù)試劑盒（CCK8）檢測細胞存活率；酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測細胞上清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）；免疫熒光法檢測細胞活性氧（ROS）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V-FITC/PI）雙染法檢測細胞凋亡；蛋白免疫印跡（Western Blot）實驗檢測細胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3Ⅱ）、細胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ（LC3Ⅰ）、自噬蛋白（p62）、高爾基體外膜蛋白（GOLPH3）的蛋白表達；實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-qPCR）實驗檢測GOLPH3表達。結(jié)果：與NG組相比，HG組RGC-5細胞存活率明顯降低，ROS、MDA明顯升高，SOD明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，LC3Ⅱ蛋白明顯升高，LC3Ⅰ、p62蛋白明顯降低，GOLPH3的mRNA和蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。黃芪甲苷（20、40、60、80、100 μmol/L）處理高糖誘導RGC-5細胞最適濃度為60 μmol/L。黃芪甲苷明顯反向調(diào)控HG組細胞上述指標。沉默GOLPH3能夠明顯增強黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞中上述指標的負向調(diào)控。結(jié)論：黃芪甲苷可減輕高糖誘導RGC-5細胞的損傷，抑制高糖誘導的氧化應(yīng)激、凋亡和自噬，其潛在的機制與激活高爾基體應(yīng)激有關(guān)。

關(guān)鍵詞" 糖尿病視網(wǎng)膜病變；黃芪甲苷；高爾基體應(yīng)激；人視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；氧化應(yīng)激；凋亡；自噬

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.16.009

糖尿病視網(wǎng)膜病變是一種糖尿病眼部并發(fā)癥，主

要為糖尿病微血管病變和神經(jīng)病變，該病也是成年人失明的主要原因［1］。糖尿病視網(wǎng)膜病變占糖尿病病人的24.7%～35.7%［2］。目前對糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療包括抗血管生成藥物管理、激光治療和外科治療，治療效果不能令人滿意，因此，迫切需要尋找新的治療方法。黃芪是一種傳統(tǒng)的中草藥，其廣泛用于治療病毒和細菌感染、炎癥以及癌癥。黃芪甲苷是黃芪水提物的主要化合物之一，其為一種三萜糖苷類化合物［3］。迄今為止，許多細胞和動物模型的研究表明，黃芪甲苷對心血管、肺、腎和腦具有十分有效的保護作用［4-5］。也有研究報道了黃芪甲苷在糖尿病中的治療價值［6］，但是其發(fā)揮作用的機制仍有待研究。高爾基磷蛋白3（Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3）參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的分選、修飾，對維持高爾基體結(jié)構(gòu)、功能的穩(wěn)定至關(guān)重要［7-8］。本研究旨在探究黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞氧化應(yīng)激、凋亡、自噬的調(diào)控作用及其機

基金項目" 河北省醫(yī)學科研課題計劃（No.20201437）；保定市科技計劃項目（No.2141ZF008）

作者單位" 1.唐山南湖醫(yī)院（河北唐山 063000）；2.河北省第七人民醫(yī)院；3.開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院；4.開灤總醫(yī)院；5.保定市第二醫(yī)院（河北保定 071000）

通訊作者" 王雅清，E-mail：lwh19820917@126.com

引用信息" 張茜玉，黃坤，李紅敏，等.黃芪甲苷通過高爾基體應(yīng)激調(diào)控高糖誘導RGC-5細胞氧化應(yīng)激、凋亡、自噬的機制研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（16）：2938-2942.

制與高爾基體應(yīng)激之間的關(guān)系。

1" 材料與方法

1.1" 材料

人視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5購自美國菌種保藏中心；黃芪甲苷（批號：84687-43-4，純度≥98%）購自成都德思特生物；LipofectamineTM3000脂質(zhì)體購自美國Invitrogen；細胞計數(shù)試劑盒（CCK8）購自日本同仁化學研究所；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒均購自南京建成生物；活性氧（ROS）檢測試劑盒購自北京普利萊；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自日本TAKARA；細胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3Ⅱ）、細胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ（LC3Ⅰ）、p62、GOLPH3一抗及辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗均購自上海艾博抗。

1.2" 方法

1.2.1" 細胞培養(yǎng)

RGC-5細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在飽和濕度的37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，48 h更換依稀培養(yǎng)基。

1.2.2" 分組與處理

用5、35 mmol/L葡萄糖處理48 h的RGC-5為正常（NG）組、高糖（HG）組；黃芪甲苷（20、40、60、80、100 μmol/L）與35 mmol/L葡萄糖共同處理24、48、72 h的RGC-5為20、40、60、80、100 μmol/L組，從中篩選最適濃度60 μmol/L處理48 h的細胞設(shè)為黃芪甲苷組；黃芪甲苷＋si-NC組、黃芪甲苷＋si-GOLPH3組為3倍LipofectamineTM3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染無意序列、si-GOLPH3序列（CAGAAGAATGGTACAAATCCAAG）后并用高糖和黃芪甲苷共處理的RGC-5細胞。

1.2.3" CCK8實驗檢測細胞存活率

按照CCK8試劑盒要求操作。調(diào)整細胞至0.5×105個/mL，取200 μL接種96孔板，細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，再加入CCK8反應(yīng)液10 μL，混勻后，孵育15 min。490 nm波長，檢測細胞吸光度。細胞存活率（%）＝OD490實驗組/OD490對照組×100%。

1.2.4" 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測細胞上清MDA、SOD的釋放

按照SOD活性檢測試劑盒、MDA含量檢測試劑盒中的說明書要求操作。處理細胞，按照說明書步驟操作，分析判定上清中MDA、SOD的含量。

1.2.5" 免疫熒光法檢測細胞ROS

按照ROS檢測試劑盒說明書要求操作。準備1 000倍稀釋的2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），孵育細胞1 h。清洗細胞后，用熒光顯微鏡觀察，拍照。實驗重復3次，每次做3個復孔。

1.2.6" Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

4 ℃預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗待檢測細胞5次后，用500 μL的結(jié)合緩沖液重懸。各取5 μL Annexin V-FITC、PI置于細胞，混合均勻，避光孵育20 min。過300目篩后在流式儀上檢測分析細胞的凋亡情況。細胞總凋亡率（%）＝早期凋亡率＋晚期凋亡率。實驗重復3次，每次做3個復孔。

1.2.7" Western Blot檢測細胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62、GOLPH3蛋白表達

RIPA裂解液冰上裂解30 min，提取總蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法定量，沸水浴變性，取上清上樣。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）液進行蛋白電泳。轉(zhuǎn)膜儀濕轉(zhuǎn)法將蛋白移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。封閉處理后，進行一抗（500～2 000倍稀釋）孵育和二抗（500倍稀釋）孵育。凝膠成像系統(tǒng)顯影曝光，Image J分析條帶灰度值。實驗重復3次，每次做3個復孔。

1.2.8" 實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-qPCR）實驗檢測GOLPH3表達

TRIzol液提取細胞總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成cDNA。RT-qPCR檢測cDNA中GOLPH3的表達情況。2－△△Ct法計算GOLPH3/GAPDH的相對表達量。GOLPH3：正向引物為5′-ACTGTTCCTGTTTTGGGTTTC-3′，反向引物為5′-CAGATGTTTGCCTTTGGTGA-3′；GAPDH：正向引物為5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，反向引物為5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.3" 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析處理。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析及LSD-t檢驗，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2" 結(jié)nbsp; 果

2.1" 不同濃度黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞存活率的影響

與NG組相比，HG組RGC-5細胞24、48、72 h的存活率均明顯降低（P＜0.05）。與24 h或72 h相比，黃芪甲苷（20、40、60、80、100 μmol/L）處理48 h的RGC-5細胞存活率均明顯升高（P＜0.05），且在60 μmol/L濃度細胞存活率最高。故選用60 μmol/L的黃芪甲苷用于后續(xù)實驗研究。詳見圖1、表1。

2.2" 黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞氧化應(yīng)激水平的影響

與NG組相比，HG組RGC-5細胞ROS、MDA的釋放量均明顯升高，SOD的釋放量明顯降低（P＜0.05）；與HG組相比，黃芪甲苷組細胞ROS、MDA釋放量均明顯降低，SOD釋放量明顯升高（P＜0.05）。詳見圖2、表2。

2.3" 黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞凋亡的影響

與NG組相比，HG組RGC-5細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與HG組相比，黃芪甲苷組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。詳見圖3、表3。

2.4" 黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞自噬的影響

與NG組相比，HG組RGC-5細胞LC3Ⅱ蛋白表達量明顯升高，LC3Ⅰ、p62的蛋白表達量均明顯降低（P＜0.05）；與HG組相比，黃芪甲苷組細胞LC3Ⅱ蛋白表達量明顯降低，LC3Ⅰ、p62的蛋白表達量均明顯升高（P＜0.05）。詳見圖4、表4。

2.5" 黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞高爾基體應(yīng)激反應(yīng)的影響

與NG組相比，HG組RGC-5細胞GOLPH3的mRNA和蛋白表達均明顯升高（P＜0.05）；與HG組相比，黃芪甲苷組細胞GOLPH3的mRNA和蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）。 詳見圖5、表5。2.6" 沉默GOLPH3增強黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞的保護作用

與黃芪甲苷＋si-NC組相比，黃芪甲苷＋si-GOLPH3組細胞GOLPH3的mRNA、蛋白表達降低，細胞存活率升高，LC3Ⅱ蛋白表達量明顯降低，LC3Ⅰ、p62的蛋白表達量均明顯升高，凋亡率明顯降低，ROS、MDA均明顯降低，SOD明顯升高（P＜0.05）。詳見圖6、表6。

3" 討" 論

黃芪甲苷是從黃芪中提取的高純度天然產(chǎn)物，具有多種生物活性，包括增強免疫系統(tǒng)、抗凋亡、抗應(yīng)激和抗氧化等［9］。研究表明，黃芪甲苷可抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和內(nèi)皮細胞的死亡，恢復細胞功能，其潛在機制與黃芪甲苷的抗氧化作用有關(guān)［10］。Qiao等［11］研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導的大鼠視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞經(jīng)黃芪甲苷處理后，細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)得到明顯抑制，細胞的存活率明顯升高，說明黃芪甲苷對高糖損傷大鼠視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞的保護作用與其抗氧化功能顯著升高有關(guān)。Wang等［12］研究報道，黃芪甲苷改善了糖尿病模型大鼠的視網(wǎng)膜病變，并降低了大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞的凋亡，并上調(diào)miR-128表達，抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路。Tang等［13］研究報道，黃芪甲苷可減輕高糖誘導的視網(wǎng)膜色素上皮細胞的損傷，其機制可能是：抑制miR-138-5p表達，增加沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（Sirt1）/核因子紅細胞生成素2相關(guān)因子2（Nrf2）通路活性和細胞抗氧化能力，以減輕細胞焦亡，降低細胞死亡率。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的黃芪甲苷呈濃度依賴性促進高糖誘導的RGC-5細胞存活，篩選出最適濃度60 μmol/L。黃芪甲苷明顯下調(diào)了高糖誘導RGC-5細胞ROS、MDA及LC3Ⅱ，上調(diào)了SOD、LC3Ⅰ、p62，實驗結(jié)果再次證明黃芪甲苷在高糖環(huán)境下對視網(wǎng)膜的保護作用。

高爾基體在氧化應(yīng)激中具有類似內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體的反應(yīng)，其也可捕獲、傳導氧化應(yīng)激，誘發(fā)高爾基體應(yīng)激反應(yīng)［14］。GOLPH3為高爾基體應(yīng)激反應(yīng)標志物，常用來反映高爾基體應(yīng)激的狀態(tài)。Maria等［15］發(fā)現(xiàn)，YIPF5基因純合子突變的遺傳性早發(fā)糖尿病、小頭癥、癲癇綜合征患兒表現(xiàn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和β細胞衰竭，增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體應(yīng)激誘導的β細胞和神經(jīng)元的凋亡。范玉琪等［16］報道，糖尿病大鼠心肌組織中GOLPH3表達升高，GOLGA2表達降低，在高糖誘導的心肌細胞模型中也表現(xiàn)相同的變化，經(jīng)外源性精胺處理后，高糖對心肌的損傷得到明顯恢復，高爾基體應(yīng)激得到明顯減輕，揭示高爾基體應(yīng)激參與外源性精胺對高糖誘導心肌細胞的保護過程。本研究發(fā)現(xiàn)，高爾基體應(yīng)激蛋白GOLPH3在高糖誘導的RGC-5細胞中表達升高，黃芪甲苷處理能夠抑制GOLPH3的表達水平，說明高爾基體應(yīng)激反應(yīng)在高糖處理的RGC-5細胞活性增強，并且高爾基體應(yīng)激反應(yīng)也許能夠被黃芪甲苷抑制。為了進一步探究二者之間的關(guān)系，沉默GOLPH3后，黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞的保護作用得到了明顯的增強，證明了高爾基體應(yīng)激在黃芪甲苷減輕高糖對RGC-5細胞損傷過程中的關(guān)鍵作用。

綜上所述，黃芪甲苷減輕了高糖對RGC-5細胞增殖、氧化應(yīng)激、凋亡和自噬的影響，產(chǎn)生這種保護作用的潛在機制與抑制高爾基體應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，為黃芪甲苷在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的臨床應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2022-12-01）

（本文編輯王麗）