養(yǎng)陰生肌散通過AMPK/mTOR信號通路調(diào)控自噬改善 克羅恩病腸纖維化的作用機(jī)制研究

〔摘要〕 目的 探討?zhàn)B陰生肌散通過腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（AMPK/mTOR）信號通路調(diào)控自噬改善克羅恩病大鼠腸纖維化的作用機(jī)制。方法 將28只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、美沙拉嗪組（420 mg/kg）、養(yǎng)陰生肌散組（100 mg/kg），每組7只。參考Morris方法制備克羅恩病腸纖維化模型，藥物組均灌腸0.5 mL，1次/d，共4周。觀察大鼠的一般情況，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評分；對結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色并行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評分、組織學(xué)病變評分，進(jìn)行Masson染色并行纖維化指數(shù)評分；采用Western blot法檢測AMPK、mTOR、核糖體蛋白S6激酶（p70S6K）、真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（4EBP1）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）蛋白水平；運(yùn)用RT-PCR法檢測肌球蛋白樣BCL2結(jié)合蛋白（Beclin-1）、螯合體1（P62）的mRNA水平。結(jié)果 與對照組比較，模型組體質(zhì)量下降百分率分?jǐn)?shù)顯著上升（Plt;0.01），DAI評分、CMDI評分、組織學(xué)病變評分、纖維化指數(shù)評分均顯著增高（Plt;0.01）；LC3Ⅱ/LC3I、p-AMPK/AMPK、p-4EBP1/4EBP1、p-mTOR/mTOR表達(dá)量顯著降低（Plt;0.01），p-p70S6K/p70S6K顯著增高（Plt;0.01）；Beclin-1表達(dá)量明顯降低（Plt;0.01），P62表達(dá)量明顯增高（Plt;0.01）。與模型組比較，美沙拉嗪組和養(yǎng)陰生肌散組體質(zhì)量下降百分率分?jǐn)?shù)均顯著升高（Plt;0.01），DAI評分、CMDI評分、組織學(xué)病變評分、纖維化指數(shù)評分均顯著降低（Plt;0.01）；LC3Ⅱ/LC3I、p-AMPK/AMPK、p-4EBP1/4EBP1、p-mTOR/mTOR表達(dá)量顯著升高（Plt;0.01），p-p70S6K/p70S6K顯著降低（Plt;0.01）；Beclin-1表達(dá)量明顯上升（Plt;0.05），P62表達(dá)量明顯下降（Plt;0.01）。結(jié)論 養(yǎng)陰生肌散可能通過AMPK/mTOR通路介導(dǎo)的自噬激活改善克羅恩病腸纖維化。

〔關(guān)鍵詞〕 克羅恩病；腸纖維化；養(yǎng)陰生肌散；自噬；AMPK/mTOR信號通路

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０25.03.003

The mechanism of action of Yangyin Shengji Powder in alleviating intestinal fibrosis in Crohn disease by regulating autophagy through AMPK/mTOR signaling pathway

DAI Hui， LIU Jiali， LIU Qiaoling， LI Xinran， BIAN Conghui， QIAN Haihua， ZHANG Dan*

Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing， Jiangsu 210029， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the mechanism of action of Yangyin Shengji Powder （YYSJP） in alleviating intestinal fibrosis in rats with Crohn disease by regulating autophagy through the adenosine monophosphate-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin （AMPK/mTOR） signaling pathway. Methods A total of 28 rats were randomly divided into control group， model group， mesalazine group （420 mg/kg）， and YYSJP group （100 mg/kg）， with 7 rats in each group. The intestinal fibrosis model of Crohn disease was prepared according to the Morris method. The drug group was given enema of 0.5 mL once a day for a total of four weeks. The general condition of rats was observed， and the disease activity index （DAI） was calculated; HE staining on colon tissue was performed to evaluate the colonic mucosa damage index （CMDI） and histological lesion score. Masson staining was used to evaluate the fibrosis index; Western blot was applied to measure the protein levels of AMPK， mTOR， ribosomal protein S6 kinase （p70S6K）， eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1 （4EBP1）， and microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3）. RT-PCR was employed to measure the mRNA levels of Beclin-1 and sequestosome 1 （P62）. Results Compared with the control group， the body weight loss percentage in the model group significantly elevated （Plt;0.01）， DAI score， CMDI score， histological lesion score， and fibrosis index score all significantly increased （Plt;0.01）; LC3Ⅱ/LC3I， p-AMPK/AMPK， p-4EBP1/4EBP1， and p-mTOR/mTOR expression levels significantly decreased （Plt;0.01）， while p-p70S6K/p70S6K significantly increased （Plt;0.01）; Beclin-1 expression level significantly decreased （Plt;0.01）， and P62 expression level significantly increased （Plt;0.01）. Compared with the model group， the body weight loss percentage of the mesalazine group and YYSJP group both significantly increased （Plt;0.01）. DAI score， CMDI score， histological lesion score， and fibrosis index score all significantly decreased （Plt;0.01）; the expression levels of LC3Ⅱ/LC3I， p-AMPK/AMPK， p-4EBP1/4EBP1， and p-mTOR/mTOR all significantly increased （Plt;0.01）， while p-p70S6K/p70S6K significantly decreased （Plt;0.01）; Beclin-1 expression level significantly increased （Plt;0.05）， and P62 expression level significantly decreased （Plt;0.01）. Conclusion YYSJP may alleviate intestinal fibrosis in Crohn disease by regulating autophagy through AMPK/mTOR signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Crohn disease; intestinal fibrosis; Yangyin Shengji Powder; autophagy; AMPK/mTOR signaling pathway

克羅恩病（Crohn disease，CD）的常見并發(fā)癥之一是腸纖維化，主要表現(xiàn)為黏膜肌層、固有肌層增厚和增生，反復(fù)發(fā)作會(huì)引起腸狹窄及腸梗阻，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。流行病學(xué)研究表明，在CD確診10年內(nèi)，超過50%的患者發(fā)展成腸穿孔或腸狹窄，需手術(shù)進(jìn)一步干預(yù)，且約20%的患者需要再次行手術(shù)切除[2]。為避免手術(shù)干預(yù)或縮小手術(shù)時(shí)腸道切除的范圍，盡早控制腸道纖維化對于CD治療至關(guān)重要。生物制劑和免疫抑制劑作為CD的推薦方案，療效往往受該病長期反復(fù)發(fā)作、慢性進(jìn)展等疾病特點(diǎn)影響[3]。因此，CD腸纖維化的發(fā)病機(jī)制仍待進(jìn)一步明確，臨床預(yù)防和治療藥物亟待研發(fā)。

腸纖維化的發(fā)生發(fā)展主要涉及間充質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子和腸系膜脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞類型[4]。這些細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和信號通路的異常激活，引發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）過度沉積，并可能觸發(fā)細(xì)胞自噬[5]。細(xì)胞自噬是維持腸道細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵過程，可以通過降解受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)（特別是成纖維細(xì)胞中的膠原蛋白）來預(yù)防纖維化的發(fā)展[6]。此外，自噬在改善與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能相關(guān)的疾病中，如炎癥性腸病中，發(fā)揮了重要作用[7]。研究表明，激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）上游的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信號通路可以抑制自噬，而腺苷酸活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase， AMPK）和p53等信號通路則可以通過負(fù)調(diào)控mTOR激活自噬[8]。因此，抑制mTOR通路已被認(rèn)為是控制腸纖維化的潛在治療策略之一[9]。故本研究以AMPK/mTOR通路作為切入點(diǎn)，探討自噬與CD腸道纖維化之間的關(guān)系。

CD屬于中醫(yī)學(xué)“泄瀉”范疇，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，通常以脾虛為本，濕熱瘀毒為標(biāo)[10]。濕熱瘀毒長期蘊(yùn)結(jié)于腸道，引發(fā)炎癥反應(yīng)和節(jié)段性的透壁性潰瘍，最后可能發(fā)展為腸纖維化甚至腸狹窄。研究表明，養(yǎng)陰生肌散能夠縮小潰瘍面積、減小潰瘍深度、控制炎癥、修復(fù)纖維損傷[11-12]，但尚未見其在CD腸纖維化研究中報(bào)道。本研究以三硝基苯磺酸（3-nitrobenzenesulfonic acid hydrate， TNBS）誘導(dǎo)制備急性腸纖維化模型后，予養(yǎng)陰生肌散灌腸干預(yù)，通過觀察大鼠體質(zhì)量、疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index， DAI）、結(jié)腸組織損傷宏觀表現(xiàn)及病理形態(tài)、結(jié)腸組織纖維化程度及自噬水平，探討?zhàn)B陰生肌散對CD腸纖維化的潛在抗纖維化機(jī)制。

1 材料

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

8周齡SPF級Wistar大鼠28只，雌雄各半，體質(zhì)量（230±50） g[上海計(jì)劃生育科學(xué)研究所，許可證號：SCXK（滬）2018-0006]。予自由進(jìn)食、飲水，室溫（22±2） ℃，相對濕度55%±5%，光照12 h晝夜交替。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、美沙拉嗪組、養(yǎng)陰生肌散組，每組7只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始造模。本研究所有處置均符合南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)范與要求（倫理號：2020DW-30-01）。

1.2" 藥物制備

養(yǎng)陰生肌散由雄黃、甘草、龍膽、青黛、黃柏、牛黃、冰片、生石膏、兒茶、蒲黃、薄荷組成，由江蘇省中醫(yī)院制劑部統(tǒng)一制備提供（蘇藥制字：Z04000546）。

1.3" 主要試劑與儀器

Tris-HCl（1.5 mol/L，pH 8.8）、Tris-HCl（1 mol/L，pH 6.8）（白鯊生物公司，批號：BL516B、BL514B）；30%丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、過硫酸銨、三（羥甲基）氨基甲烷（美國Bio-Rad公司，批號：161-0156、161-0302、161-0700、161-0719）；Trizol試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：R1100）；美沙拉嗪灌腸液（德國Dr.Falk Pharma GmbH公司，批號：16kS4）；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、AMPK、mTOR、p-mTOR、真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（e IF4E-binding protein 1， 4EBP1）、核糖體蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase， p70S6K）、肌球蛋白樣BCL2結(jié)合蛋白（moesin-like BCL2 interacting protein， Beclin-1）、螯合體1（sequestosome-1， p62）（美國Proteintech公司，批號：14600-1-AP、10929-2-AP、66888-1-Ig、67778-1-Ig、83890-5-RR、14485-1-AP、11306-1-AP、18420-1-AP）；p-AMPK、p-4EBP1、p-P70S6K（美國Abcam公司，批號：ab133448、ab278686、ab59208）。

恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號：DNP-9022）；垂直電泳系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司，型號：24DN）；凝膠成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號：3200-97001）；酶標(biāo)儀（深圳市雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號：RT-6000）；臺式高速冰凍離心機(jī)[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司，型號：LR5K001727]；恒溫金屬浴（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號：TU-100）；紫外分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司，型號：SMA2000）；RT-PCR試劑盒[翌圣生物科技（上海）股份有限公司，型號：11201ES03]；PCR儀（德國Eppendorf公司，型號：6311000070）；qPCR熒光定量系統(tǒng)（杭州博日科技股份有限公司，型號：FQD-96A）。

2 方法

2.1" 模型制備和干預(yù)

參照Morris方法制備CD腸纖維化模型[13]。造模前24 h禁食、自由飲水。將大鼠稱重后，以3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg體質(zhì)量）麻醉大鼠，灌腸器插入肛門6～9 cm，灌入TNBS+50%乙醇混合液0.5 mL，倒置大鼠全身1 min后平臥，待其自然清醒，放回籠中。灌腸共6次，每周1次，前3周分別以15、30、45 mg灌腸，后3周以60 mg維持。造模大鼠體質(zhì)量明顯下降，出現(xiàn)稀便及血便癥狀提示造模成功[13]。造模成功后，對照組、模型組每日給予蒸餾水0.5 mL灌腸。美沙拉嗪組按420 mg/（kg·d）灌腸給藥、養(yǎng)陰生肌散組按100 mg/（kg·d）灌腸給藥[14]，總體積均為0.5 mL，共干預(yù)4周。

2.2" 取材

所有干預(yù)結(jié)束后，以3%的戊巴比妥鈉（100 mg/kg）麻醉，脫椎處死大鼠，迅速分離結(jié)腸組織標(biāo)本，觀察大鼠結(jié)腸組織的大體表現(xiàn)，剪取病損明顯的兩段結(jié)腸，一段置于-80 ℃冰箱中保存待用，另一段于多聚甲醛溶液中固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片。

2.3" 一般情況與疾病活動(dòng)指數(shù)

觀察大鼠造模后體質(zhì)量、糞便黏稠度、糞便潛血，計(jì)算DAI評分[15]。DAI=（體質(zhì)量下降百分率分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)）/3。DAI評分共有3個(gè)條目，包括體質(zhì)量下降百分率、大便黏稠度、便血，每個(gè)條目計(jì)0～4分。0分為無癥狀，4分為癥狀程度最高，評分越高代表炎癥活動(dòng)度越高。

2.4" HE染色觀察結(jié)腸組織損傷及病理形態(tài)改變

參照結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（colonic mucosa damage index，CMDI）[16]評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸組織損傷評分，將固定在多聚甲醛中的結(jié)腸組織梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，行結(jié)腸石蠟切片和HE染色。顯微鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)，并進(jìn)行組織學(xué)病變評分[17]。CMDI評分共有3個(gè)條目，包括腹瀉（0～1分）、潰瘍（0～10分）、組織粘連（0～2分），評分越高代表結(jié)腸損傷程度越重。組織學(xué)病變評分參數(shù)包括炎癥程度（0～3分）、損傷程度（0～3分）、隱窩損傷（0～4分），評分越高代表病理形態(tài)改變程度越重。

2.5" Masson染色檢測結(jié)腸組織纖維化水平

將固定在多聚甲醛中的結(jié)腸組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟和Masson染色。顯微鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織纖維化程度，并進(jìn)行纖維化指數(shù)評分[18]。纖維化指數(shù)評分按照膠原蛋白沉積部位和范圍計(jì)分（0～4分），評分越高說明纖維化程度越高。

2.6" Western blot檢測結(jié)腸組織蛋白的表達(dá)

用RIPA裂解液提取結(jié)腸組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每次電泳取20 μg上樣，電泳分離蛋白，半干法電轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉。分別加入以1∶1 000比例稀釋的一抗（AMPK、p-AMPK、m-TOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、p70S6K、p-p70S6K、LC3），4 ℃孵育過夜。PBST洗滌條帶3次，每次4 min，加入二抗，室溫孵育1 h。PBST洗滌3次，每次4 min，加入適量ECL，置入PVDF膜上，曝光顯影拍照。使用Image J軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算相對表達(dá)量。

2.7" RT-PCR檢測結(jié)腸組織mRNA的表達(dá)

采用TRizol試劑盒提取結(jié)腸組織總RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度和純度，用RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)GeneBank中所列基因序列，由Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成基因的引物。引物序列如下：Beclin-1正向5'-ATGGAGGGGTCTAAGGCGTC-3'、反向5'-TCCTCTCCTGAGTTAGCCTCT-3'；P62正向5'-GGCACCGGAGGGTTTAA？鄄TTTT-3'、反向5'-GCAGGTGTTGTTCCAAAGTTG-3'；GAPDH正向5'-ACTCCACTCACGGCAAATTCAA-3'、反向5'-ACATACTCAGCACCGGCCTCAC-3'。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性和延伸95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。采用SYBR法于實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，每份樣品均進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔測定，通過分析軟件得到樣品閾值循壞數(shù)。

2.8" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以“ｘ±s”表示，兩組間采用配對樣本t檢驗(yàn)分析，多組間比較采用單因素方差分析，Plt;0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行作圖。

3 結(jié)果

3.1" 養(yǎng)陰生肌散對CD腸纖維化大鼠一般情況及DAI的影響

與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量下降百分率分?jǐn)?shù)顯著上升（Plt;0.01），DAI評分顯著增加（Plt;0.01）。與模型組比較，美沙拉嗪組和養(yǎng)陰生肌散組大鼠體質(zhì)量下降百分率分?jǐn)?shù)和DAI評分均顯著下降（Plt;0.01）。詳見圖1。

3.2" 養(yǎng)陰生肌散對CD腸纖維化大鼠結(jié)腸組織損傷以及組織病理形態(tài)的影響

與對照組比較，模型組腸壁上皮層結(jié)構(gòu)破壞，隱窩丟失，黏膜層輕度水腫，杯狀細(xì)胞減少，大量炎癥細(xì)胞浸潤，且累及黏膜下層，黏膜下層和肌層成纖維細(xì)胞堆積，纖維結(jié)締組織增生，肌層略有增厚。與模型組比較，美沙拉嗪組和養(yǎng)陰生肌散組腸壁上皮結(jié)構(gòu)較完整，隱窩排列整齊，黏膜層水腫緩解，炎癥細(xì)胞減少，黏膜下層和肌層纖維組織減少，增厚不明顯。詳見圖2。

與對照組比較，模型組的CMDI評分、組織學(xué)病變評分均顯著升高（Plt;0.01）。與模型組比較，養(yǎng)陰生肌散組和美沙拉嗪組CMDI評分、組織學(xué)病變評分均顯著降低（Plt;0.01）。詳見圖3。

3.3" 養(yǎng)陰生肌散對CD腸纖維化大鼠結(jié)腸組織纖維化程度的影響

對照組大鼠結(jié)腸組織呈現(xiàn)出均勻的藍(lán)染，其中肌肉纖維和血管等結(jié)構(gòu)清晰可見，無明顯的纖維化病變。與對照組比較，模型組大鼠黏膜層、黏膜下層和部分肌層彌漫性藍(lán)染，纖維原性膠原沉積較多，組織結(jié)構(gòu)輕度改變，腸道慢性炎癥伴隨纖維化形成。與模型組比較，美沙拉嗪組與養(yǎng)陰生肌散組膠原蛋白沉積范圍縮減，纖維化表達(dá)降低，組織間分界較清晰。詳見圖4。

與對照組比較，模型組大鼠的纖維化評分顯著升高（Plt;0.01）。與模型組比較，美沙拉嗪組與養(yǎng)陰生肌散組纖維化評分均顯著降低（Plt;0.01）。詳見圖5。3.4" 養(yǎng)陰生肌散對CD腸纖維化大鼠結(jié)腸組織LC3、AMPK/mTMOR調(diào)控通路相關(guān)分子表達(dá)量的影響

與對照組比較，模型組LC3Ⅱ/LC3I、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1表達(dá)量均顯著降低（Plt;0.01），p-p70S6K/p70S6K表達(dá)量顯著增高（Plt;0.01）。與模型組比較，美沙拉嗪組和養(yǎng)陰生肌散組LC3Ⅱ/LC3I、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1表達(dá)量均顯著升高（Plt;0.01），p-p70S6K/p70S6K表達(dá)量顯著降低（Plt;0.01）。詳見圖6。

3.5" 養(yǎng)陰生肌散對CD腸纖維化大鼠結(jié)腸組織自噬相關(guān)分子水平的影響

與對照組比較，模型組Beclin-1 mRNA表達(dá)量下降（Plt;0.01），P62 mRNA表達(dá)量顯著增加（Plt;0.01）。與模型組比較，美沙拉嗪組和養(yǎng)陰生肌散組Beclin-1 mRNA表達(dá)量增加（Plt;0.05），P62 mRNA表達(dá)量顯著降低（Plt;0.01）。詳見圖7。

4 討論

隨著全球CD發(fā)病率的持續(xù)升高[19]，腸纖維化已成為CD并發(fā)癥治療的一大挑戰(zhàn)。長期纖維化常導(dǎo)致腸道狹窄和腸梗阻，給患者帶來沉重的身心和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[20]。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，濕熱瘀毒是腸纖維化的核心病機(jī)，治療當(dāng)以清熱利濕、解毒祛瘀為主要原則[21-22]。養(yǎng)陰生肌散作為外用散劑，其治療口瘡療效顯著，由江蘇省中醫(yī)院對其化裁改良后，該方劑被用于CD患者的基礎(chǔ)治療中，療效顯著[23]。

腸纖維化被認(rèn)為是慢性炎癥不斷刺激腸道黏膜，造成ECM過度沉積的結(jié)果[24]。目前，腸纖維化防治策略多側(cè)重于抑制炎癥。雖然炎癥會(huì)引發(fā)纖維化，但有研究表明，纖維化過程可獨(dú)立進(jìn)行并自我維持[25]。研究顯示，自噬及其相關(guān)通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡，影響ECM的合成和降解，進(jìn)而決定纖維化的程度[26]。因此，自噬、ECM和纖維化之間存在著復(fù)雜的相互調(diào)控關(guān)系，為干預(yù)腸纖維化提供了潛在的治療途徑[27]。腸纖維化小鼠模型中，自噬抑制會(huì)加重纖維化程度，而自噬激活會(huì)阻止纖維化進(jìn)程[6]。以上表明，調(diào)控自噬可能是改善CD腸纖維化程度的機(jī)制之一。

AMPK/mTOR信號通路是自噬調(diào)控的經(jīng)典途徑之一。通常情況下，磷酸化的mTOR抑制自噬，而AMPK通過去磷酸化mTOR促進(jìn)自噬，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和代謝[8]。AMPK還可通過直接磷酸化UNC-51樣自噬激活激酶1啟動(dòng)自噬[28]，為自噬發(fā)生的重要起點(diǎn)。AMPK/mTOR通路在自噬的調(diào)控中起關(guān)鍵作用，表明其是治療纖維化疾病的潛在靶點(diǎn)。磷酸化的4EBP1被視為mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)重要標(biāo)志物[29]，研究發(fā)現(xiàn)，氯硝柳胺乙醇胺鹽通過mTOR/4EBP1信號通路促進(jìn)自噬，并抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和ECM積累[30]。此外，p70S6K是mTOR的主要下游靶點(diǎn)，在調(diào)節(jié)纖維化和抑制自噬中起關(guān)鍵作用。ZHENG等[31]研究表明，利拉魯肽能抑制心肌細(xì)胞mTOR/p70S6K信號，顯著增強(qiáng)自噬活性，從而有效抑制心肌纖維化。在自噬過程中，LC3I可通過類泛素樣反應(yīng)轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ，后者結(jié)合于自噬體膜上，參與調(diào)控自噬體的成熟和降解。因此，LC3Ⅱ/LC3I比值被稱為自噬活性的“指示器”[32]。P62通過自噬降解，當(dāng)自噬受到抑制時(shí)，P62會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累，這一現(xiàn)象常被視為自噬受阻的標(biāo)志[33]。Beclin-1參與自噬的起始階段，蛋白表達(dá)水平在自噬后上調(diào)[34]。二甲雙胍通過上調(diào)Beclin-1和LC3Ⅱ的表達(dá)，調(diào)控AMPK/mTOR信號通路，從而增強(qiáng)自噬活性，緩解二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化[35]。這提示AMPK/mTOR信號通路在其他類型纖維化（如肝纖維化和腸纖維化）中的應(yīng)用潛力。

本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，養(yǎng)陰生肌散組的DAI評分顯著降低，結(jié)腸組織損傷及病理形態(tài)得到明顯改善，LC3Ⅱ/LC3I、AMPK、4EBP1磷酸化水平顯著升高，p70S6K磷酸化水平顯著降低，Beclin-1表達(dá)量升高以及P62表達(dá)量下降。這些變化提示養(yǎng)陰生肌散在減輕腸纖維化方面具有顯著療效，其具體的作用機(jī)制可能是通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路及其下游分子，增強(qiáng)自噬活性，從而發(fā)揮其抗腸纖維化的作用。

在生理狀態(tài)下，自噬誘導(dǎo)和mTOR激活之間存在緊密的反向偶聯(lián)[36]。本研究探索養(yǎng)陰生肌散通過抑制mTOR通路從而促進(jìn)自噬改善腸纖維化，而mTOR磷酸化水平升高，與預(yù)期不符。mTOR蛋白有多個(gè)可以進(jìn)行磷酸化的殘基，其磷酸化具有復(fù)雜性，mTOR檢測靶點(diǎn)的磷酸化不一定反映mTOR激酶活性的增加，也不應(yīng)作為mTOR激活的衡量標(biāo)準(zhǔn)。有研究認(rèn)為，mTOR的調(diào)節(jié)和功能在很大程度上取決于mTOR對接或相關(guān)的蛋白[37]。因此，本研究對mTOR活化的分析可側(cè)重于下游蛋白和效應(yīng)蛋白，如p70S6K和4EBP1。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4EBP1磷酸化水平顯著升高，p70S6K磷酸化水平顯著降低，自噬水平上調(diào)，結(jié)果符合預(yù)期。

綜上所述，本研究表明養(yǎng)陰生肌散能夠有效改善CD腸纖維化，其可能通過AMPK/mTOR通路激活自噬，從而抑制腸道成纖維細(xì)胞的合成，為防治CD腸道纖維化提供了思路。本研究尚存在一定的局限性，例如樣本量較少等。此外，本研究尚未進(jìn)行臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，限制了其臨床應(yīng)用的推廣。未來的研究應(yīng)開展大樣本、多中心、雙盲實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)養(yǎng)陰生肌散在CD腸纖維化治療中的療效與安全性。

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