不同基原積實的多組分含量測定及差異性成分分析

中圖分類號R917 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（2025）09-1071-05

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2025.09.09

ABSTRACTOBJECTIVETodetermine thecontentsof15componentsinAurantiiFructus Immaturus fromdiferentorigins （Citrusaurantium，C.junos，CurantiumLin.，C.sinensisOsb.，C.sinensis），screendierentialcomponents，dprovide references forthequalityevaluationof AurantiiFructus Immaturus.METHODSHPLCmethod wasadopted todetermine the contentsof synephrine， N . -methyltyramine，5，7-dihydroxychromone-7-neohesperidoside，neoponcirin，narirutin，naringin， hesperidin，neohesperidin，naringenin，hesperetin，siensetin，nobiletin，tangeretin，5-demethylnobiletin，andauraptenein46 batches of Aurantii Fructus Immaturus from diferent origins.The determination was performed on Waters Symmetry column with mobile phase consisted of acetonitrile- . 0 . 1 % formic acid（gradient elution）at the flow rate of ；column temperature was set at ，detection wavelength was 2 8 4 n m ，and sample injection volume was 5 μ L .The differences between different originsof AurantiiFructus Immaturuswereanalyzedbyclusteranalysis，principalcomponent analysis（PCA）andorthogonal partialleastsquares-discriminantanalysis（OPLS-DA），anddiferentialcomponentswerescreened.RESULTSThelinear relationships of theaforementioned15 components were all good within the tested massconcentrationranges（all ）. The

RSDs for precision，stability（ 2 4 h ） ，and repeatabilitytests were all less than 2 . 0 0 % . The average recovery rate ranged from 9 1 . 1 % to 1 0 3 . 9 % （allRSDs ）.Cluster analysis， PCA，and OPLS-DA revealed that C. sinensis Osb.and C sinensis were clustered into one category，while C.aurantium，

C. junosandC.aurantiumLinn.wereclusteredintoanothercategory.Thevariable importance projectionvalues forneohesperidin， auraptene，naringin，neoponcirin，tangeretin，hesperidin，inensetin，and5，7-diydroxychromone-7-neohesperidoidewerel greaterthan1.CONCLUSONSInthisstudy，thecontentsof15components inAurantiiFructusImmaturus from diferentorigins aredetermiedndirtialponnts，cdingespridiratene，ringinndopoirinredout KEYWORDsAuranti Fructus Immaturus；origins；multivariable statistics；content determination；differential components

積實為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙C.sinensisOsbeck的干燥幼果，主產于江西、湖南、湖北、重慶等地，其中江西為枳實的道地產區。枳實味苦、辛、酸，微寒，歸脾、胃經，具有破氣消積、化痰散痞的功效，多用于治療積滯內停、痞滿脹痛、大便秘結、瀉痢后重、胃下垂、子宮脫垂、脫肛等，其主要含有黃酮類、生物堿類等活性成分[1-4]。枳實中黃酮類成分主要以柚皮昔、新橙皮昔為主，生物堿類成分以辛弗林為主2-；黃酮類成分具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、助消化等作用，生物堿類成分具有收縮外周血管、升壓等作用[6。枳實變種基原（如香橙、臭橙、臍橙）較多，相關研究發現，不同基原積實之間的化學成分含量也截然不同[8-10]。因此，分析不同基原枳實與化學成分之間的內在關系、明確差異性成分，具有重要意義。基于此，本研究采用高效液相色譜法建立枳實中13種黃酮類成分（5，7-二羥基色酮-7-新橙皮糖苷、新北美圣草苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素、5-去甲川陳皮素、橙皮油素）和2種生物堿類成分（辛弗林、N-甲基酪胺）的含量測定方法，并對46批不同基原積實進行含量測定，同時進行多元統計分析，篩選差異性成分，以期為積實的質量評價及基原鑒定提供參考。

1材料

1.1 主要儀器

DIONEXUItiMate3000型高效液相色譜儀購自美國ThermoFisherScientific公司；BT25S型電子天平購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；ML204T型電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Milli-QDirect16型純水系統購自美國Millipore公司。

1.2主要藥品與試劑

辛弗林（批號110727-202110，純度 100 % ）、柚皮蕓香昔（批號112080-202201，純度 100 % ）柚皮苷（批號110722-202116，純度 9 3 . 5 % ）、橙皮苷（批號110721-202019，純度 9 5 . 3 % ）新橙皮苷（批號111857-201804，純度 9 9 . 4 % ）、川陳皮素（批號112055-202102，純度9 9 . 7 % ）、橘皮素（批號112054-202102，純度 9 9 . 7 % ）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；柚皮素（批號AF20110451，純度 9 8 % ）、橙皮素（批號AF20092151，純度 9 8 % ）、甜橙黃酮（批號AFBL0902，純度 9 8 % ）橙皮油素（批號AFB2091，純度 9 8 % ）對照品均購自成都埃法生物科技有限公司；N-甲基酪胺（批號wkq22102703，純度9 8 % ）、5-去甲川陳皮素（批號wkq21052610，純度 9 8 % ）對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司；新北美圣草苷（純度 9 9 . 9 % ）、5，7-二羥基色酮-7-新橙皮糖苷（純度 100 % ）對照品均為本實驗室自制；乙晴、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

不同基原積實樣品共46批，其中樣品 的基原為酸橙 的基原為香橙、 S 2 6～S 37 的基原為臭橙、 的基原為臍橙、 的基原為甜橙；樣品 Δ S 1 ～ S 2 、 、S11 ～ S13、S16 ～ S19、 S 2 3～ 為本課題組于2022年5月下旬至6月中旬采集，樣品 購自江西青峰藥業有限公司，樣品 、S25、S33購自江西宏益藥業有限公司。

2 方法與結果

2.1混合對照品溶液的制備

取辛弗林、N-甲基酪胺、5，7-二羥基色酮-7-新橙皮糖苷、新北美圣草苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素、5-去甲川陳皮素、橙皮油素對照品適量，加甲醇配制成質量濃度分別為33.1500、25.7152、10.2000、54.3456、1 1 1 . 7 5 0 0 . 2 9 1 . 7 2 0 0 . 8 6 . 5 3 2 4 . 1 9 8 . 1 6 3 8 . 1 8 . 5 0 2 4 . 4 . 5 0 8 0 ， 1 2 . 5 4 4 0 ， 4 0 . 0 0 0 0 ， 2 6 . 1 2 1 4 ， 4 . 2 6 8 8 ， 1 8 . 8 9 4 4 μ g / m L 的混合對照品母液。精密量取混合對照品母液5mL，置于 2 0 m L 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取積實樣品粉末（過三號篩）1g，精密稱定，加甲醇2 5 m L ，稱定質量；加熱回流 3 0 m i n ，放冷，再次稱定質量；用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

采用WatersSymmetry 色譜柱 m m， 5 μ m ，以乙腈（A） . 0 . 1 % 甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（ 0 ～ 4 0 m i n ， ： 4 0 ～5 0 m i n ；流速為 柱溫為 ；進樣量為 5 μ L ;檢測波長為 2 8 4 n m 。

2.4方法學考察

2.4.1 專屬性試驗

取“2.1”“2.2”項下混合對照品溶液和供試品溶液（樣品編號S16）適量，按“2.3\"項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（圖1）。結果顯示，待測各成分與其相鄰峰間的分離度均大于1.5，理論板數以新橙皮苷計不低于8000，且空白溶液（甲醇）在相應位置無干擾，表明該方法的專屬性較好。

1：辛弗林；2：N-甲基酪胺；3：5，7-二羥基色酮-7-新橙皮糖苷；4：新北美圣草苷；5：柚皮蕓香苷；6：柚皮苷；7：橙皮苷；8：新橙皮苷；9：柚皮素；10：橙皮素；11：甜橙黃酮；12：川陳皮素；13：橘皮素；14：5-去甲川陳皮素；15：橙皮油素。

2.4.2 線性關系考察

精密量取“2.1\"項下混合對照品母液 1 、 1 、 5 、 5 m L 分別置于 2 0 ， 1 0 ， 2 0 ， 1 0 m L 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得4個質量濃度點的系列混合對照品溶液。吸取上述系列混合對照品溶液和混合對照品母液適量，按“2.3\"項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以待測成分質量濃度為橫坐標 （ X ， μ g / m L ）、峰面積為縱坐標（Y繪制標準曲線，結果見表1。

2.4.3 精密度試驗

取供試品溶液（樣品編號S16）適量，按“2.3\"項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。結果顯示，15個待

測成分峰面積的RSD均小于 1 . 5 2 % 中 n = 6 ，表明儀器的精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗

取供試品溶液（樣品編號S16）適量，在室溫下放置0 ， 2 ， 4 ， 8 ， 1 2 ， 1 8 ， 2 4 h 時，按“2.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果顯示，15個待測成分峰面積的RSD均小于 1 . 9 8 % （ n=7 ） ，表明供試品溶液在室溫下放置 2 4 h 內穩定性良好。

2.4.5 重復性試驗

取枳實樣品（編號S16）6份，按\"2.2\"項下方法制備供試品溶液，再按\"2.3\"項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，并采用外標法計算樣品中15個待測成分的含量。結果顯示，15個待測成分含量的RSD均小于 1 . 7 9 % （ n = 6），表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗

取積實樣品（編號S16）約 ，共6份，精密稱定，每份以 的比例加入相應待測成分的對照品；按\"2.2\"項下方法制備供試品溶液，再按\"2.3\"項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，并計算各成分的加樣回收率和RSD值。結果顯示，辛弗林 ?? N ? 甲基酪胺、5，7-二羥基色酮-7-新橙皮糖苷、新北美圣草苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素、5-去甲川陳皮素、橙皮油素的平均加樣回收率分別為 9 4 . 5 % . 9 1 . 1 % . 9 2 . 8 % . 9 5 . 3 % . 9 6 . 1 % . 9 8 . 2 % . 9 5 . 5 % ≈ 1 0 1 . 6 % . 1 0 2 . 2 % . 9 6 . 7 % . 9 3 . 9 % . 1 0 3 . 9 % . 9 9 . 9 % ！9 8 . 6 % . 9 7 . 1 % ，RSD分別為 1 . 9 8 % . 2 . 0 7 % . 2 . 1 2 % . 1 . 7 7 % 、1 . 3 2 % ！ 1 . 1 9 % ！ 2 . 0 3 % ！ 1 . 3 9 % 、 3 . 0 3 % ！ 2 . 4 8 % 、 2 . 0 0 % 、1 . 8 5 % ， 1 . 9 3 % ， 2 . 2 2 % ， 1 . 2 3 % （ n = 6 ） ，表明該方法的準確度較好。

2.4.7 樣品含量測定

取46批積實樣品粉末（過三號篩）各 1 g ，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3\"項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，再采用外標法計算各待測成分的含量。平行測定3次，取平均值。結果見表2。

2.5 積實的多元統計分析

2.5.1 聚類分析

以46批積實樣品中15種成分的含量測定結果為變量，將其導人邁維在線工具（https：//cloud.metware.cn/#/home），采用組間連接方式，以Ward.D2法作為合并規則進行聚類分析。結果（圖2）顯示，當平方歐氏距離為20時，46批積實被聚為2類：樣品 （即甜橙、臍橙基原積實）聚為一類， （即酸橙、香橙、臭橙基原枳實）聚為另一類。

20 車 15 10 5 688888883 88863

2.5.2 主成分分析

將46批積實樣品中15種成分的含量測定結果導入邁維在線工具（https：//cloud.metware.cn/#/home），進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。結果（圖3）顯示，46批積實樣品可聚為2類，即樣品 S 3 8 ～ S46（即甜橙、臍橙基原枳實）聚為一類， （即酸橙、香橙、臭橙基原積實）聚為另一類，與聚類分析結果一致。

2.5.3 正交偏最小二乘-判別分析

將46批積實中15個成分的含量測定結果導人邁維在線工具（https：//cloud.metware.cn/#/home），進行正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partialleast squares-discriminantanalysis，OPLS-DA）。由OPLS-DA得分圖（圖4）可知，46批積實樣品可聚為2類，即樣品 （即甜橙、臍橙基原枳實）聚為一類， （即酸橙、香橙、臭橙基原積實）聚為另一類，與聚類分析、PCA結果一致。OPLS-DA模型中， ，均大于0.5，表明該模型穩定可靠。進一步通過模型擬合分析得到變量重要性投影（variable importance projection，VIP）值，以VIP值 gt;1 為標準，篩選不同基原枳實的差異性成分。結果（圖5）顯示，VIP值 gt;1 的成分分別為新橙皮苷、柚皮苷、橙皮油素、新北美圣草苷、橘皮素、甜橙黃酮、橙皮苷、5，7-二羥基色酮-7-新橙皮糖苷。

3 討論

3.1樣品前處理方法的考察

本研究考察了不同提取溶劑（ 5 0 % 甲醇、甲醇和乙醇）提取方式（超聲和回流）以及提取時間（10、30、45min）對樣品提取效果的影響。結果發現，以甲醇為提取溶劑得到的供試品溶液的色譜信息較豐富，且響應比較均衡;加熱回流的提取效果要優于超聲提取，回流提取3 0 m i n 和 4 5 m i n 無顯著區別。因此，本研究采用甲醇回流提取 3 0 m i n 作為樣品的提取方法。

3.2 色譜條件的選擇

本研究采用二極管陣列檢測器對供試品溶液進行1 9 0～4 0 0 n m 范圍的全波長掃描，結果發現，大部分成分在 2 8 4 n m 附近有較大的紫外吸收，響應較好，因此本研究選擇 2 8 4 n m 作為檢測波長。在流動相選擇上，本研究考察了甲醇-水、甲醇 . 0 . 1 % 甲酸、乙腈-水、乙腈 . 0 . 1 % 甲酸對各成分分離效果的影響，結果顯示，以乙腈 . 0 . 1 % 甲酸作為流動相時，各成分分離效果最佳。

3.3多組分含量及差異性成分分析

本研究對46批積實中15種成分的含量進行測定，并采用聚類分析、PCA、OPLS-DA對樣品進行多元統計分析。結果顯示，甜橙和臍橙基原枳實聚為一類，酸橙、香橙、臭橙基原枳實聚為另一類，這提示甜橙、臍橙基原積實與酸橙、香橙、臭橙基原枳實存在較大差異。《中國植物志》記載：甜橙分為3大類，即普通臍橙、甜橙和血橙;臭橙和香橙為酸橙的不同栽培類型[1I-12]。由此可知，本研究結果將甜橙、臍橙基原積實歸為一類，將酸橙、香橙、臭橙基原積實歸為另一類是合理的。進一步篩選出不同基原枳實的差異性成分為新橙皮昔、橙皮油素、柚皮苷、新北美圣草苷、橘皮素、橙皮苷、甜橙黃酮、5，7-二羥基色酮-7-新橙皮糖苷，且酸橙、香橙、臭橙基原積實中5，7-二羥基色酮-7-新橙皮糖苷、新北美圣草苷、柚皮苷、新橙皮苷、橘皮素、橙皮油素的相對含量遠高于甜橙、臍橙基原枳實，而橙皮昔、甜橙黃酮的相對含量遠低于甜橙、臍橙基原枳實。

綜上所述，本研究測定了不同基原枳實中15種成分的含量，并結合多元統計分析篩選出了不同基原枳實的差異性成分，可為積實藥材的質量評價及基原鑒定提供參考。

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（編輯：唐曉蓮）