廣西喀斯特地區五個桑樹品種葉功能性狀及其抗旱性評價

Functional traits and drought resistance evaluation of leaves from five mulberry varieties in Guangxi karst region

QIN Lanli’，CHEN Guanrong'，LI Yanting’，XIE Yanjun’，LI Xiaodong' HUANG Kangdong2，WEN Liuying3， SHI Chenyu1 *

（1.GuangxiKyLboaoyofSrcutureEoogndApedItellgentTog，GuagilbatieIaonCentfde SericulturediliClUesKbatofxplatodUlfoaldtlsol ofChemisty，chUityOai；chuehte SilkwormEggodoCntec46Oaii；isericuureeeoetCentesa）

Abstract：Inorder to select Morus alba（mulberry）varieties with high drought resistance suitable for planting in the karst areas of Guangxi，this study investigated five mulberryvarieties from Huanjiang region，namely‘Guisang 5’， ‘Guisang 6’，‘Guisangyou 12’，‘Nongsang 14’，and‘Yu 711'.A total of 24 leaffunctional traits were measured， including chlorophyll，osmotic regulatorysubstances，anthocyanidin，malondialdehyde，antioxidant enzyme activities，as well as anatomical traitssuch asconduit diameter，conduit wallreinforcement，leaf thickness，upperand lower epidermis thickness，palisade mesophyllthickness，spongy mesophyll thickness，stomatal size，and stomatal density， etc.These traitswere evaluated through principal component analysis，membership functionanalysis，and cluster analysis toidentifyleaffunctional traitsasociatedwithdroughtresistanceandtoselectthevarieties withstrongerdrought resistance.Theresultswereas follows：（1）Principalcomponent analysisrevealed thatthekeyleaffunctional traits associatedwith droughtresistance in thefive mulberryvarietieswerechlorophylla，chlorophyllb，total chlorophyll， carotenoid，malondialdehyde，superoxide dismutaseactivity， stomatal size， stomatal density，conduit wall reinforcement，and spongytisue thickness.These traitswere found to have significant corelationswith the drought resistance of thevarieties.（2）The membership function analysis rankedthe drought resistance of the five varieties as follows：‘Nongsang 14' gt; ‘ Guisangyou 12' gt; ' Guisang 5'gt; ' Guisang 6' gt; ‘ Yu 711’. This ranking was confirmed by the subsequent cluster analysis，which grouped‘Nongsang 14’，‘ Guisangyou 12’，and‘Guisang 5^° together，while ‘Guisang Σ^6′ and‘Yu 711’were placed in a separate group. The cluster analysis results were consistent with the membership function analysis.（3）‘Nongsang 14’，‘Guisangyou 12’，and‘Guisang 5’exhibited beter drought resistance，which wasatributed to their more eficient physiological regulation mechanismsandoptimal anatomical features.The findings ofthisstudyprovideascientific foundationandtheoreticalreference fortheselectionof droughtresistant mulberry varieties in the karst regions of Guangxi.

Key Words： karst areas，Morus alba（mulberry），leaf functional traits，membership function，clustering analysis， drought resistance

桑樹（Morusalba）在我國已有超過5000年的種植歷史，是家蠶養殖的主要飼料來源（秦儉等，2010；Jiaoetal.，2020）。廣西河池市目前是全國最大的蠶桑生產基地（黃康東等，2023），其桑園面積和蠶繭產量等指標連續多年位居榜首，桑蠶產業已成為當地優勢特色產業（唐燕梅等，2022；陳張晴等，2023）。然而，該地區屬于典型的喀斯特地貌，分布有大量巖溶發育形成的石山丘陵和洼地，土層淺且保水性較差（Querejetaetal.，2007；Schwinning，2008；Aritsaraetal.，2023），桑樹作為高水分消耗的樹種（沈萩荻等，2019），加上其較淺的根系結構（時連輝等，2005），若在生長過程中遇到水分虧缺會導致其葉片泛黃，品質不佳，進而影響家蠶的養殖。因此，選擇適合廣西喀斯特地區種植的抗旱性強的桑樹品種具有重要意義。

植物葉片功能性狀主要包括葉片解剖結構和生理等一系列可測量的指標（孫梅等，2017），與植物抗旱性密切相關（Chengetal.，2017；李金航等，2020；Lietal.，2021）。在干旱脅迫下，植物細胞內會產生大量活性氧（CruzdeCarvalho，2008），導致質膜發生脂質化過氧反應，產生丙二醛，造成氧化損傷。為了抵御這種損傷，植物體內的自由基抗氧化物酶，如超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶，會被激活以清除活性氧（葉龍華等，2014；Wangetal.，2019；黃加煌等，2024）。隨著干旱脅迫的加劇，超過某個臨界點時葉綠體會變形，其片層結構會遭到破壞，進而導致葉綠素的含量降低（張小嬌等，2014）。此外，植物通過增加脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等滲透調節物質的含量來降低滲透勢，增強對干旱的抵抗力，這些物質的含量直接反映了植物對逆境的適應能力（Wangetal.，2019;黃加煌等，2024）。李春情等（2024）研究表明，抗旱性強的植物相較于抗旱性弱的植物，具有較低的丙二醛含量、較強的抗氧化酶活性和更多的滲透調節物質。在干旱環境下，葉功能性狀的解剖結構也表現出特有的特征，抗旱性強的植物葉片通常具有較厚的角質層、發達的柵欄組織、較高的柵欄組織/海綿組織比例和氣孔密度及排列緊密且較細長的細胞等特征（邱權等，2014；Oliveiraetal.，2018）。此外，韓淑華等（2021）在對桑樹同源多倍體葉片的解剖結構與抗旱性關聯性的研究發現，抗旱性強的四倍體相對于抗旱性較弱的二倍體親本，表現出海綿組織厚度、柵欄組織厚度、下表皮厚度、葉片厚度、葉片緊實度增加的特點。

目前，對桑樹的抗旱性研究多為分子水平（曾睿等，2022）解剖結構（沈萩荻等，2019；韓淑華等，2021）、干旱脅迫的生理響應（莫榮利等，2017；劉丹等，2022）等方面，少有將解剖結構和生理兩方面的葉功能性狀指標相結合的研究。然而，植物的抗旱性是多個指標共同作用的結果，單一指標難以準確鑒定其抗旱性。孫冬嬋等（2024）和孫明震等（2024）指出，植物抗旱性的評價需采用多指標綜合分析方法，如主成分分析、隸屬函數分析和聚類分析，以避免單一指標的局限性。因此，本研究以環江地區常見的5個桑樹品種為試驗對象，測定了葉綠素、滲透調節物質及丙二醛的含量和抗氧化酶活性等12個生理指標，以及葉片厚度、上下表皮厚度、柵欄組織、海綿組織、氣孔大小、氣孔密度等12個葉片解剖結構指標，共24個葉功能性狀指標，結合主成分分析、隸屬函數分析和聚類分析，旨在研究以下內容：（1）與5個桑樹品種抗旱性相關的葉功能性狀指標；（2）評價5個桑樹品種的抗旱性。本研究結果為喀斯特地區篩選抗旱性強的桑樹品種提供科學依據和理論參考。

1材料與方法

1.1試驗地點和材料

本試驗所用桑樹材料均取自廣西農投時宜智慧桑園（環江園區， 107^°51^′-108^°43^′E，24^°44^′- 25^°33^′N ，海拔 220m ），選用‘桂桑5號’‘桂桑6號‘桂桑優 ₁₂? ‘農桑14號'和‘育711號'5個品種作為試驗材料。各品種所選的試驗個體生長在同一種植區域的三年生植株，均由前年冬季伐條后，今年春季（3月，為旱季）從新枝條上生長出的植株葉片。依照王學奎（2018）的試驗方法，分別從每個品種中選取10棵長勢相近的植株采集第6至第7葉位的葉片，用于生理指標的測定。同時，再選取每個品種5個不同個體的第6至第7葉位的健康成熟葉片，用于解剖結構測定。分別裝入自封袋帶回實驗室，放置 4^°C 冰箱中保存備用。

1.2試驗方法

1.2.1生理指標的測定采用丙酮-乙醇提取法測定葉綠素和類胡蘿卜素含量（史沉魚和韋云秀，2021）；采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量（王學奎，2018）；采用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量（史沉魚和韋云秀，2021）；采用酸性芘三酮顯色法測定游離脯氨酸含量（王學奎，2018）；采用鹽酸甲醇法測定花青素含量（史沉魚等，2024）；采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶活性（王學奎，2018）；采用愈創木酚法測定過氧化物酶活性（劉新和劉洪慶，2018）；采用過氧化氫法測定過氧化氫酶活性（王學奎，2018）；采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛含量（王學奎，2018）。

1.2.2解剖結構的測定用于解剖的葉片先避開主脈和二級脈，切成 1cm² 左右的小葉片，再放入裝有Frankin離析液（ ：H₂O₂：CH₂COOH= 1：1 V/V的離心管中， 70% 烘箱加熱 ⁴h ，冷卻后清水洗凈，使用 1% 的阿力新藍染色 15min ，制成臨時裝片，放置光學顯微鏡下觀察氣孔并隨機拍攝保存5個視野的照片，采用ImageJ1.53c圖形測量氣孔面積即為氣孔大小，氣孔密度為氣孔數量除以視野面積。

各品種取上述5片葉子沿著主脈和葉片進行徒手切片，先漂白 2min ，再依次用 1% 的番紅溶液染色 15min 和 1% 的阿力斯亮藍溶液染色 5min 制成臨時裝片。于光學顯微鏡下觀察并拍照，采用ImageJ1.53c圖形處理軟件分別測定上下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片厚度、導管長軸和短軸、導管壁厚度。導管加固系數為導管壁厚度與導管長軸的比值，單個導管直徑按照橢圓面積進行計算。根據以下公式計算導管直徑（D） （Scholz et al.，2013）：

D=（d⁴/N）^0.25 式中： d 為單個導管直徑； N 為導管系數。

1.3數據處理與分析

使用 R4.1.0 版本的ggplot2包進行柱形圖作圖。單因素方差分析（one-wayANOVA）、主成分分析和聚類分析均在SPSS27.0統計軟件進行單因素方差分析用于分析不同品種各指標間的差異；主成分分析選出能代表5個桑樹品種的主要抗旱性指標，用于隸屬函數進行綜合評價和系統聚類分析。隸屬函數計算公式如下（王謐等，2014） ：

式中： X_i 為某一指標的測定值； X_min 為某一測定指標的最小值； X_max 為某一測定指標的最大值。用反隸屬函數計算與抗旱性呈負相關的指標，公式如下：

將各指標的隸屬函數值進行累加，取其平均值，得到綜合評定指數，其值越大表示抗旱性越強

2 結果分析

2.15個桑樹品種的葉功能性狀

可溶性糖含量最低的是‘農桑14號’且其類胡蘿卜素含量也最低（圖1：A；表1），但葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素的含量最高（表1）。‘桂桑6號'具有最高的可溶性蛋白、花青素、丙二醛的含量和過氧化物酶活性（圖1：B、D、E、F），但其脯氨酸含量最低（圖1：C）。脯氨酸含量最高的是‘桂桑5號'且其胡蘿卜素含量也最高（圖1：C；表1），而丙二醛、葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素的含量最低（圖1：E；表1）。‘桂桑優12’的超氧化物歧化酶活性最高（圖1：G）;超氧化物歧化酶活性最低的是‘育711號’且其過氧化物酶活性也最低（圖1：F、G），而類胡蘿卜素、可溶性糖的含量及過氧化氫酶活性最高（表1;圖1：A、H）。

不同桑樹品種的葉片在解剖結構組成上是相似的，都是由上下表皮、柵欄組織、海綿組織及維管束組成。上下表皮均為單層細胞，柵欄組織位于上表皮下面，為長柱狀，排列緊密但長度不一，‘農桑14號‘除了在上表皮下含有柵欄組織，在靠近下表皮部分還含有一層柵欄組織，海綿組織位于兩層柵欄組織中間，多為短柱狀，排列緊密（圖2）。維管束是葉片主脈的核心部分，由木質部和韌皮部組成，木質部位于維管束最內側，主要由導管組成（圖3）。

由表2可知，導管直徑變化范圍為 13.67～ 17.62μm ，桂桑5號'最大，同時其導管加固系數值最小，為0.077，上表皮和葉片的厚度最薄，分別為 17.82μm 和 86.55μm ，氣孔最小，面積為121.47μm² ，氣孔密度最大，為47.6 ind.·mm^-2 。導管加固系數最高的是‘桂桑6號’，為0.094，其次為‘桂桑優 ₁₂? ，‘桂桑6號‘的上表皮和葉片的厚度最厚，分別為 22.78μm 和 107.47μm ，氣孔密度最小，為 30.6ind.?mm^-2 ；‘桂桑優 ₁₂? 的下表皮最薄，為 7.38μm ，海綿組織厚度最大，為42.09μm ，葉片組織緊密度最低，為 21.98% ，疏松度最高，為 43.95% ，柵海比最低，為0.54；下表皮厚度最大的是‘農桑14號’，為 8.43μm ，柵欄組織厚度最大，為 26.66μm ，葉片組織結構緊密度最高，為27.95% ；‘育711號’的柵海比和氣孔最大，分別為0.91和 201.59μm² 。

綜上所述，5個桑樹品種的各項指標表現各異且在不同指標上的排序有所不同，難以通過單一指標評價抗旱性。

2.25個桑樹品種葉功能性狀指標的主成分分析

將5個桑樹品種的葉功能性狀指標進行主成分分析。由表3可知，經主成分提取后，3個主成分的累積貢獻率已達 90.219% ，保留了24個指標的大部分信息。根據載荷值越大，其對主成分貢獻越大、典型性越強的原則，對3個主成分進行分析。第一主成分貢獻率最高，為 40.749% ，丙二醛、葉綠素a、葉綠素 b 、總葉綠素、類胡蘿卜素、氣孔大小、氣孔密度具有較大的載荷值；第二主成分貢獻率為 25.132% ，超氧化物歧化酶這一指標具有較大的載荷值;第三主成分貢獻率為 24.338% ，導管加固系數、海綿組織厚度具有較大的載荷值。3個主成分包含的10個指標載荷值高，包含的信息量大，因此，篩選出丙二醛等10個指標作為評價5個不同桑樹品種的抗旱性強弱的指標。

2.3與抗旱性相關的葉功能性狀指標的隸屬函數分析

通過主成分分析從24項指標中篩選出丙二醛、葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素、氣孔大小、氣孔密度、超氧化物歧化酶、導管加固系數和海綿組織厚度10個指標進行隸屬函數分析，隸屬函數平均值越大，表示該植物的抗旱性越強。10個指標中與植物抗旱性呈負相關的丙二醛、氣孔大小和海綿組織3個指標用反隸屬函數計算，7個正相關的指標用正隸屬函數計算。由表4可知，5個桑樹品種的隸屬平均值由大到小依次為0.574、0.559、0.538、0.404、0.367，因此抗旱性從強到弱依次為‘農桑14號’gt;‘桂桑優 12^?gt;^?"桂桑5號'gt;‘桂桑6號' gt; ‘育711號’。

2.4與抗旱性相關的葉功能性狀指標的聚類分析

利用系統聚類對主成分分析篩選出的10個指標進行聚類分析。由圖4可知，在標度為25時可將其分為兩類：第一類是‘育711號’和‘桂桑6號’；第二類是‘桂桑優12’‘農桑14號'和‘桂桑5號’。同一類說明在結構上具有較大的相似性，進化演變相似性較大，抗旱性也類似，這與前面隸屬函數分析的結果相似，第一類與第二類相比，抗旱能力排名靠后。

3 討論與結論

植物的抗旱性是受多種因素的共同作用，涉及葉功能性狀的多個特征，因此需要結合多個指標綜合評價抗旱性（李瑞雪等，2017；孫梅等，2017）。例如，孫冬嬋等（2024）認為影響高山海拔地區油茶的抗旱性主要指標為柵海比、葉面積、葉脈厚度和柵欄組織厚度4個指標；季琳琳等（2023）研究發現，柵欄組織厚度、葉片組織結構的緊密度和疏松度、柵海比是5個山核桃品種的抗旱性典型指標；張慶華等（2018）發現過氧化氫酶、過氧化物酶、丙二醛含量等5個生理指標是不同草莓品種抗旱性鑒定的重要指標。本研究中，‘桂桑6號’雖然在解剖結構上具有最高的氣孔密度和導管加固系數，但在生理方面，其丙二醛含量最高，超氧化物歧化酶活性最低，因此抗旱性偏低，而抗旱性最強的‘農桑14號’不僅擁有較高的導管加固系數，也含有最高的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量及較強的超氧化物歧化酶活性，表明桑樹抗旱性需基于葉功能性狀的多指標綜合評價，單一指標無法準確評價。

表25個桑樹品種的葉片解剖指標分析

表3主成分分析結果

本研究對24個指標進行主成分分析，篩選出葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、胡蘿卜素、超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、氣孔大小、氣孔密度、導管加固系數和海綿組織厚度10個指標作為評價桑樹抗旱性的葉功能性狀指標。韓淑華等（2021）在對桑樹的抗旱性研究中，將柵欄組織厚度、葉片厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度和上角質層厚度5個解剖結構指標作為桑樹抗旱性的評價指標。劉丹等（2022）將丙二醛、過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖8個生理指標用來評價9個桑樹品種的耐旱性。本研究結果與上述研究部分指標存在差異，在本研究的主成分分析中，柵欄組織厚度、葉片厚度、下表皮厚度、可溶性蛋白、可溶性糖及過氧化物酶、過氧化氫酶的載荷值低于 80% ，不作為抗旱性評價的相關指標，這可能與桑樹品種間的遺傳差異或是其所處不同的生長環境相關。一方面，不同桑樹品種的抗旱基因存在差異，這些差異可能導致它們在響應干旱脅迫時的葉功能性狀有所不同（曾睿等，2022），所以某些指標可能在特定品種中更能反映抗旱性。另一方面，植物的抗旱性與其生長環境的干旱脅迫程度密切相關。如劉丹等（2022）研究在不同梯度的干旱脅迫處理下，會不可避免地導致植物生理指標發生相應的變化。相比之下，本研究聚焦于在喀斯特自然環境條件下生長的桑樹，該環境下的干旱脅迫可能與實驗室條件存在差異，因此不一定會引起所有生理指標的同程度響應。

表4隸屬函數分析結果

植物的抗旱性評價需要使用隸屬函數分析和系統聚類分析相互驗證，以證實結果的可靠性。本研究通過隸屬函數分析和系統聚類分析將主成分分析篩選出的10個能代表抗旱能力的指標分別進行分析，隸屬函數分析得出5個桑樹品種的抗旱性由強到弱依次為‘農桑14號’gt;‘桂桑優12^?gt;^? 桂桑5號'gt;‘桂桑6號'gt;‘育711號’，聚類分析結果將‘農桑14號’‘桂桑優12’和‘桂桑5號'聚為一類，‘桂桑6號’和‘育711號'組成另一類，兩者的結果相互印證，增強了結果的可靠性，這與前人研究在相同分析框架下對8種桑科榕屬植物的解剖結構進行抗逆性綜合評價的研究結果相吻合，以及在干旱脅迫條件下對不同草莓品種進行生理指標測定以評估其抗旱性的研究結論相一致（朱栗瓊等，2012；張慶華等，2018）。本研究發現，‘農桑14號’‘桂桑優12’和‘桂桑5號‘這3種強抗旱性品種的抗旱性代表指標的平均隸屬函數值都不低于0.5，表明與另外2個桑樹品種相比，它們具有更為高效的生理調節機制和優化的解剖結構。當受到干旱脅迫時，抗旱性強的植物通常可以維持較高的葉綠素含量以保持光合作用正常進行，并且更強的超氧化物歧化酶活性可以清除活性氧及降低丙二醛的生成，從而減輕氧化損傷（張慶華等，2018；黃加煌等，2024）。

此外，在解剖結構方面，導管加固系數與植物抗栓塞能力（代表植物的抗旱性，一般用導水率喪失50% 時的木質部水勢 P₅₀ 表示）密切相關（覃蘭麗等，2022），其可作為預測 P₅₀ 的優勢參數，其值越高，代表抗旱性越強（Scholzetal.，2013）。本研究篩選出的抗旱品種為今后喀斯特地區桑樹的選育和栽培提供科學依據，未來的研究可以從分子水平上探索與抗旱性指標相關的基因表達。

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