血清MP-DNA載量聯合NK細胞計數評估耐藥性肺炎支原體肺炎患兒的免疫特征研究

[摘要] 目的 探討大環內酯類藥物無反應性肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）與大環內酯類藥物敏感MPP（macrolide-susceptible MPP，MSMPP）的免疫特征差異，評估血清肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）-DNA載量及NK細胞計數在疾病進程中的臨床意義。方法 選取2022年8月至2023年8月在杭州市兒童醫院住院的120例MPP患兒作為研究對象，根據使用大環內酯類抗生素72h內是否有效分為MSMPP組（n=36）和大環內酯類藥物無反應性MPP（macrolide-susceptible MPP，MSMPP）組（n=84），比較兩組患兒入院后6h內各項指標的差異。使用多因素方差分析獨立危險因素，采用受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）分析診斷效能。結果 CD4⁺T、NK、lgMP-DNA是可預測MPP患兒是否為MUMPP的獨立危險因素。CD4⁺T、NK、lgMP-DNA、NK+CD4⁺T、lgMP-DNA+CD4⁺T、lgMP-DNA+NK的ROC曲線下面積分別為0.684、0.753、0.728、0.803、0.779、0.813。結論 外周血NK細胞減少及高MP-DNA載量是耐藥性支原體肺炎的重要臨床特征，聯合檢測可為后續診療提供重要臨床價值。

[關鍵詞] NK細胞；MP-DNA；CD4⁺T細胞；肺炎支原體肺炎

[中圖分類號] R725.6" """"[文獻標識碼] A""" [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.17.007

Study of serum MP-DNA load combined with NK cell count to evaluate immune characteristics in children with drug-resistant Mycoplasma pneumoniae pneumonia

ZHANG Kaijing¹， HUANG Xiaohui²， YU Xiaojuan¹， CHEN Junsong³

1.Hematology Department， Hangzhou Children’s Hospital， Hangzhou 310005， Zhejiang， China; 2.Special Care Ward，Hangzhou Children’s Hospital， Hangzhou 310005， Zhejiang， China; 3.Department of Respiratory Medicine， Hangzhou Children’s Hospital， Hangzhou 310005， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate immune characteristics of non-responsive macrolide-resistant Mycoplasma pneumoniae pneumonia （MPP） and macrolide-susceptible Mycoplasma pneumoniae pneumonia （MSMPP）， and the clinical significance of serum Mycoplasma pneumonia DNA load and NK cell count in the course of disease were evaluated. Methods A total of 120 MPP patients hospitalized at Hangzhou Children’s Hospital from August 2022 to August 2023 were selected as subjects， they were divided into MSMPP group （n=36） and macrolide-unresponsive MPP （MUMPP） group （n=84） based on whether they were effective within 72h of using macrolide antibiotics. Compare various indicators levels in the first 6 hours after admission between two groups. Multivariate analysis of variance was used for independent risk factors and receiver operating characteristic （ROC） curve analysis was used for diagnostic performance. Results CD4⁺T， NK， and lgMP-DNA were independent risk factors for predicting whether MPP patients were MUMPP. The area under ROC curve for CD4⁺T， NK， lgMP-DNA， NK+CD4⁺T， lgMP-DNA+CD4⁺T， and lgMP-DNA+NK were 0.684， 0.753， 0.728， 0.803， 0.779， and 0.813， respectively. Conclusion Decreased peripheral blood NK cells and high MP-DNA load are important clinical features of drug-resistant Mycoplasma pneumonia， and combined detection can provide important clinical value for subsequent diagnosis and treatment.

[Key words] NK cells; MP-DNA; CD4⁺T cells; Mycoplasma pneumoniae pneumonia

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是兒童社區獲得性肺炎的主要病原體之一。MP引起的肺炎通常是一種自限性疾病，主要使用大環內酯類抗生素治療。隨著大環內酯類藥物的廣泛使用，近幾年臨床上一些MP肺炎（MP pneumonia，MPP）對大環內酯類藥物的耐藥性逐漸升高，研究發現這些對大環內酯類藥物無反應性MP（macrolide- unresponsive MPP，MUMPP）與23SrRNA突變高度相關^[1-2]；MUMPP"" 患者常因耐藥性伴隨更嚴重的免疫紊亂。有研究報道使用二線藥物如激素、四環素、氟喹諾酮類等治療MUMPP患者^[3]。雖然MUMPP主要由MP基因突變引起，但其對宿主免疫的影響與臨床預后相關^[1]。因此，探究MUMPP的免疫特征對優化臨床治療方案（如免疫調節劑或二線抗生素的早期聯用）具有重要意義。淋巴細胞亞群是檢測人體免疫功能的重要指標，其中T淋巴細胞和B細胞數量的減少可能與肺炎的嚴重程度相關，而NK細胞水平與炎癥感染程度呈負相關^[4-5]。T淋巴細胞可分化為CD4⁺T淋巴細胞和CD8⁺T淋巴細胞，研究發現難治性MP肺炎（refractory MPP，RMPP）患者使用激素治療與未使用激素相比臨床癥狀恢復時間和病程明顯縮短，治療后較治療前的CD4⁺T值升高，CD8⁺T值降低，CD4⁺T/CD8⁺T值升高^[6]。MP感染可引起T淋巴細胞的過度活化，由此導致的衰竭可能對RMPP的產生起重要作用，表明淋巴細胞亞群動態變化與MPP疾病進展及預后具有相關性^[7-8]。本研究探討治療早期MUMPP與大環內酯類藥物敏感MPP（macrolide-susceptible MPP，MSMPP）的免疫相關指標的區別，以期對患兒使用大環內酯類藥物是否敏感進行預測。

1 "對象與方法

1.1" 研究對象

選取2022年8月至2023年8月在杭州市兒童醫院住院的120例MPP患兒作為研究對象，根據使用大環內酯類抗生素72h內是否有效分為MSMPP組（n=36）和MUMPP組（n=84）。納入標準：①患兒MP-DNA檢測為陽性；②1歲≤患兒年齡≤11歲； ③符合肺炎X線征象；④咽拭子中甲型、乙型、腺病毒、呼吸道合胞病毒核酸陰性。排除標準：①合并其他基礎疾病如腫瘤、白血病、唐氏綜合征等；②嚴重肝腎功能不全者；③2周內使用糖皮質激素治療者；④診斷為重癥肺炎者。本研究所有患兒監護人均簽署知情同意書。本研究經杭州市兒童醫院醫學倫理委員會批準【倫理審批號：（2020）年倫審（臨研）第（17）號】。

1.2" 研究方法

患兒入院后6h內抽取靜脈血進行檢測。實驗室檢測：使用流式細胞儀抗阻法測定血清中白細胞計數（white blood cell，WBC）、中性粒細胞計數（neutrophils，N）、淋巴細胞計數（lymphocyte，L）、單核細胞計數（monocyte，M）、血小板計數（platelet，PLT）；使用AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）測定血清乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase；LDH）水平；使用酶聯免疫吸附試驗測定血清C反應蛋白（C reactive protein，CRP）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）水平，試劑盒（美國貝克曼庫爾特有限公司）；ABI 7500型實時熒光定量PCR基因擴增儀（美國ABI公司）使用熒光探針法檢測MP-DNA水平，試劑盒（中國廣州中山大學達安基因股份有限公司）；使用流式細胞儀檢測患兒血清T淋巴細胞、B淋巴細胞、CD4⁺T淋巴細胞、CD8⁺T淋巴細胞、NK細胞水平。

1.3 "統計學方法

將MP-DNA進行對數化處理為lgMP-DNA，采用SPSS20.0統計學軟件對數據進行處理分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，不符合正態分布的數據以中位數（四分位數間距）[M（Q₁，Q₃）]表示，組間比較采用秩和檢驗，計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ²檢驗。采用Logistic回歸分析影響因素，采用受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）分析診斷價值。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1 "兩組患兒的臨床資料比較

MSMPP組患兒的L、PLT、T、CD4⁺T、CD8⁺T、NK細胞水平高于MUMPP組，lgMP-DNA水平低于MUMPP組，差異均有統計學意義（Plt;0.05），見表1。

2.2" 多因素Logistic分析

單因素分析結果表明WBC、L、M、PLT、T、CD4⁺T、CD8⁺T、NK細胞、lgMP-DNA的差異有統計學意義。多因素Logistic分析結果表明CD4⁺T、NK細胞、lgMP-DNA為獨立危險因素（Plt;0.05）；CD4⁺T、NK細胞水平越低，MUMPP出現的可能性越高；lgMP-DNA載量越高，MUMPP出現的可能性越高，見表2。

2.3" ROC曲線分析

NK細胞聯合CD4?T的ROC曲線下面積為0.803，lgMP-DNA聯合NK細胞的ROC曲線下面積為0.813診斷效能顯著提升，見圖1。

3 "討論

Chu等^[9]研究表明與健康對照者相比，MPP患兒的N計數、CRP、LDH、NK細胞水平均顯著升高。MUMPP組患兒的T淋巴細胞、CD4⁺T淋巴細胞、CD8⁺T淋巴細胞、NK細胞、PLT計數低于MSMPP組，差異具有統計學意義。血小板主要由巨核細胞分化成熟產生，巨核細胞分化成熟過程可刺激T淋巴細胞活化，血小板計數降低說明MUMPP可能與CD4⁺T淋巴細胞、CD8⁺T淋巴細胞受抑制有關^[10]。本研究CD8⁺T細胞無法作為判斷MUMPP的獨立危險因素，有可能因為MUMPP對CD8⁺T的抑制作用不是十分明顯所致。

本研究多因素Logistic分析結果表明NK細胞、CD4⁺T細胞和lgMP-DNA可作為判斷MUMPP的獨立危險因素。NK細胞是天然非特異性免疫淋巴細胞，對病毒、腫瘤細胞等均有一定的清除作用^[11]。研究發現NK細胞的減少也與乙型流感病毒和新冠病毒相關肺炎的進展呈正相關^[12-13]。研究發現NK細胞對細菌感染引起的上呼吸道和下呼吸道感染均有一定的免疫調節作用，說明其具有廣譜免疫保護因子的潛在價值，對MP感染引起的肺部炎癥也有一定的免疫調節作用^[14-15]。早期的動物研究發現NK細胞耗竭小鼠感染MP的耐藥性也在增加^[16]；這可能與NK細胞通過調控先天免疫反應影響MP感染的宿主防御有關，但這一機制缺乏臨床證據支持。本研究中NK細胞減少可能通過削弱免疫清除能力，加劇耐藥菌株的免疫逃逸。

MP感染可促進T淋巴細胞活化^[7]，而在動物研究中發現CD4⁺T細胞可減輕MP感染引起的炎癥反應^[17]。本研究結果表明隨著CD4⁺T細胞的減少，MPP患者進展為MUMPP患者的概率也在增加。NK細胞和CD4⁺T細胞水平均為MSMPP進展為MUMPP的獨立危險因素，可能是因為MUMPP患者對自身NK細胞和CD4⁺T細胞的消耗更加迅速，這也說明使用大環內酯類藥物治療后MUMPP與MSMPP患者體內的免疫指標具有一定差異性。

研究表明下呼吸道灌洗液中的MP-DNA載量與MPP嚴重程度呈正相關^[18]。Fang等^[19]的研究發現MPP肺泡灌洗液的MP-DNA載量高于咽拭子，但兩者的倍數具有正相關性。Lin等^[20]對6例RMPP的研究發現咽拭子的MP-DNA載量與臨床癥狀和療效呈正相關，說明上呼吸道咽拭子的MP-DNA效價可能與MPP感染的嚴重程度呈正相關，lgMP-DNA可作為MPP是否進展為重型MPP的獨立危險因素^[21]。

研究表明使用糖皮質激素對RMPP發熱時間和住院時間的縮短具有積極正面影響^[1]。研究表明使用糖皮質激素+大環內酯類藥物治療的MUMPP患者住院平均天數、持續高熱比例均低于單純使用大環內酯類藥物患兒^[3]；MUMPP和RMPP患者及早使用二線藥物有積極正面效應。Li等^[22]的研究發現RMPP患兒的T淋巴細胞、CD4⁺T、B細胞和NK細胞數值低于普通MPP且差異具有統計學意義，說明RMPP對整個淋巴免疫細胞均有明顯的抑制作用，這與本研究結果類似。

本研究CD4⁺T、NK、lgMP-DNA、lgMP-DNA+ CD4⁺T的ROC曲線下面積均低于0.8，診斷價值并不高。NK+CD4⁺T、lgMP-DNA+NK的ROC曲線下面積為0.803、0.813，但lgMP-DNA+ NK的ROC曲線的特異性和敏感度的綜合水平高于NK+CD4⁺T。本研究中MSMPP患兒數量低于MUMPP，這可能與近幾年大環內酯類抗生素使用頻繁導致耐藥性有關，但也不能排除部分輕癥或MSMPP患者在門診使用大環內酯類藥物后病情好轉并未住院治療。

本研究存在一定局限性。本研究未納入RMPP患者。綜上，MP感染后使用大環內酯類藥物是否敏感可能與NK淋巴細胞水平和MP-DNA效價有關。因此lgMP-DNA+NK的聯合診斷對判斷MPP是否進展為MUMPP具有較高的診斷價值。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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