阿膠含量定量檢測中DigitalPCR的應用研究

Application of Digital PCR in Quantitative Detection of Ejiao Content

LI Na1.2.3 WANG Yicun1.2.3 GOU Yanping4 GUO Yue5 HOU Guangyue1.2.3 ZHOU Lili1.2.3* [1.Shandong Institute forProduct Quality Inspection;2.National InspectionandTestingCenterforProcessedFood

（Shandong）;3.JinanKeyLaboratoryofFunctionalFoodQualitySafety;4.QingdaoChengyangAdministrationforMarket Regulation; 5.The Offce ofWetland Conservation and Management ofJilin Province]

Abstract：This paperdiscussesthenecessityfeasibilityandtechnicalpathof introducingthedigital polymerasechain reaction（Digital PCR）technologyintothequantitative detectionof ejiao content.Throughacomprehensive evaluationof ejiao samples，combined withDigitalPCR'sadvantagesofhighsensitivityandabsolute quantification，this paperproposes asystematictestingprocess，including thedeterminationof thesamplepopulation，thesetingoftechnical indicators and qualitycharacteristics，sampleextractionandtheevaluationof testresults.The study shows thattheDigital PCR technologycanefectivelyimprovetheaccuracyofquantitativedetectionofejiaocontentandprovidereliablequalitydata for the industry.

Keywords：ejiao content; quantitative detection;Digital PCR

0 引言

代阿膠質量控制日益嚴格的要求1。DigitalPCR作為一種先進的核酸定量檢測技術，具有高靈敏度、高準確性以及可實現絕對定量等諸多優勢。在阿膠含量定量檢測領域，DigitalPCR技術展現出了巨大的應用潛力，有望為阿膠含量的精確測定提供新的

目前，阿膠含量檢測的方法眾多，但均面臨著不同程度的挑戰。傳統的檢測手段在準確性、靈敏度和特異性等方面存在一定的局限性，難以滿足現技術支撐[2]。本研究聚焦于阿膠含量定量檢測中的DigitalPCR應用，以提高阿膠含量檢測的準確性和可靠性為目標，旨在深人探討DigitalPCR技術在阿膠含量定量檢測中的原理、方法、技術優勢以及面臨的挑戰等方面內容。通過本研究，期望為阿膠質量檢測領域提供一種更為有效的含量定量檢測方法，推動阿膠質量控制技術的發展，為保障阿膠產業的健康發展提供科學依據。

1阿膠含量定量檢測中引入DigitalPCR的必要性

阿膠作為一種傳統的名貴中藥材，其含量定量檢測結果對于阿膠產品的質量判定、市場監管以及消費者權益保護有著至關重要的意義，直接反映了檢測機構在中藥檢測方面的技術水平和質量管理能力。不同的檢測機構在阿膠含量定量檢測方面有著不同的技術手段和質量把控要求。有的機構依賴傳統檢測方法，只要沒有接到關于阿膠含量檢測結果的重大質疑或投訴，就默認其檢測結果的準確性；有的實驗室采用常規的抽檢復查機制，不定期地對已檢測的阿膠樣本進行部分復查，以此來評估檢測的可靠性[3；有的則通過與其他實驗室進行結果比對的方式，間接判斷自身阿膠含量定量檢測的準確性。在阿膠含量定量檢測過程中，對每一個檢測樣本進行全面且高精度的檢測是非常不現實的。一方面，這會耗費大量的人力、物力和時間成本；另一方面，如果采用全檢方式，容易產生一種錯誤的觀念，即認為阿膠含量檢測的準確性僅僅依靠最后的全檢篩選，仿佛只要檢測人員將不合格的檢測結果在全檢過程中排除掉就萬事大吉，這在很大程度上把保證阿膠含量定量檢測準確的責任從檢測執行人員轉移到了最后的全檢環節[4]。然而，阿膠含量定量檢測的準確性是由整個檢測過程的各個環節所共同決定的，全檢環節僅僅是為了獲取檢測結果和記錄的質量信息，它并不能從根本上提升阿膠含量定量檢測的準確性。所以，在阿膠含量定量檢測中引入一種先進、高效的檢測技術，如DigitalPCR（數字聚合酶鏈反應）是非常必要的。

2 阿膠含量定量檢測中引入DigitalPCR的可行性

在阿膠含量定量檢測領域，檢測機構往往會對檢測方法的準確性和可靠性等方面制定相應的質量目標。例如某機構在其質量目標中規定，阿膠含量定量檢測的準確率不低于 98% （誤差范圍在±2% 以內視為合格）。從現代檢測技術應用的相關準則來看，多種技術可用于中藥材含量檢測，包括傳統的高效液相色譜法（HPLC）、紫外-可見分光光度法等，也包括一些新興技術5。其中，新興技術DigitalPCR（數字聚合酶鏈反應）具有高靈敏度、高特異性和絕對定量等優勢。

從適用范圍考量，一些傳統檢測技術適用于常規的中藥材成分分析、含量范圍初步判定以及大規模樣本的初步篩選等情況。而DigitalPCR技術不僅適用于對阿膠含量進行精確的定量檢測，而且在微量成分檢測、復雜基質中目標成分檢測方面表現出色。在阿膠含量定量檢測中，檢測機構旨在為行業提供精準的含量數據以保障阿膠產品的質量，這一目的與DigitalPCR技術的功能高度契合。而且，通常進行阿膠含量定量檢測的樣本數量眾多，一般達到一定規模以便能夠準確反映產品的整體質量情況。所以，綜合來看，在阿膠含量定量檢測中引入DigitalPCR技術是可行的、恰當的。

3阿膠含量定量檢測中引入DigitalPCR的技術路徑

確定檢測樣本總體（包括不同來源、批次的阿膠樣本） $$ 確定阿膠樣本單位產品在含量定量方面的技術指標（如阿膠中特定有效成分的含量范圍等）、質量特性（例如成分的穩定性、均一性等）及檢測要求（如檢測精度、檢測限等） $$ 確定不合格阿膠樣本的分類（例如根據含量低于標準下限的程度分為嚴重不合格和輕微不合格等） $$ 規定可接受的阿膠含量定量檢測的誤差范圍等質量水平 $$ 檢索適用于阿膠含量定量檢測的DigitalPCR技術參數及操作流程（如同類樣本的最佳反應條件、引物設計原則等） $$ 抽取阿膠樣本進行DigitalPCR檢測（按照特定的抽樣規則選取代表性樣本） $$ 檢驗抽取的阿膠樣本（使用DigitalPCR技術進行精確的含量定量分析） $$ 給出阿膠含量是否合格的判斷結論（依據預先設定的質量水平判斷樣本是否合格） $$ 復查（必要時，如初次檢測結果處于臨界值附近或者結果存在爭議時，再次進行DigitalPCR檢測以確保結果的準確性）。

4 應用實例及思考

4.1確定檢測樣本總體

阿膠產品在市場上來源廣泛，包括不同產地、不同生產廠家以及不同批次的產品。本實例將收集來自多個知名阿膠生產企業、不同產地且涵蓋近三年不同批次的阿膠樣本作為檢測樣本總體，旨在全面評估阿膠產品的含量情況，保證檢測結果能代表市場上阿膠產品的整體質量水平。

4.2確定阿膠樣本單位產品在含量定量方面的技術指標、質量特性及檢測要求

4.2.1技術指標

阿膠中含有多種有效成分，如膠原蛋白、氨基酸等。以其中的特征性氨基酸-羥脯氨酸為例，根據相關質量標準及行業研究，其含量應在一定范圍內。例如，優質阿膠中羥脯氨酸的含量應不低于某一特定比例（如 8% ）。

4.2.2質量特性

阿膠樣本的質量特性主要體現在成分的穩定性和均一性上。穩定性方面，阿膠在儲存過程中，其有效成分含量應保持相對穩定，不應因環境因素（如溫度、濕度等）而發生顯著變化。均一性則要求在同一批次阿膠產品中，不同部位的樣本有效成分含量差異應在合理范圍內，以確保產品質量的一致性。

4.2.3檢測要求

為了精確測定阿膠中的有效成分含量，檢測精度要求較高。例如，對于羥脯氨酸含量的檢測，檢測限應達到 0.1% ，相對標準偏差（RSD）應控制在5% 以內，以確保檢測結果的準確性和可靠性。

4.3確定不合格阿膠樣本的分類

4.3.1嚴重不合格

如果阿膠樣本中羥脯氨酸含量低于標準下限值的 30% 以上，這將嚴重影響阿膠的質量和功效，被判定為嚴重不合格。或者阿膠樣本存在嚴重的成分混雜情況，如摻雜了其他非阿膠成分且比例超過5% ，也視為嚴重不合格。

4.3.2輕微不合格

當阿膠樣本中羥脯氨酸含量低于標準下限值，但差距在 30% 以內時，判定為輕微不合格。另外，若樣本在儲存過程中有效成分含量有一定波動，但仍在可接受范圍內（如波動范圍在 ±10% 以內），同時不影響阿膠的整體質量，也可歸為輕微不合格。

4.4規定可接受的阿膠含量定量檢測的誤差范圍等質量水平

根據行業標準和實際應用需求，本檢測規定可接受的阿膠含量定量檢測誤差范圍為 ±5% 。即檢測結果與真實值之間的偏差在 ±5% 以內視為合格。同時，要求檢測的回收率在 90%～110% 之間，以確保檢測方法的準確性。

4.5檢索適用于阿膠含量定量檢測的DigitalPCR技術參數及操作流程

4.5.1技術參數

在阿膠含量定量檢測中，針對阿膠樣本的特點，DigitalPCR的反應體系總體積為 20μL ，其中包含特定的引物濃度（如 0.2μM ）、模板DNA量（根

據樣本濃度調整）、dNTPs（ （0.2mM ）以及合適的聚合酶（如Taq酶）。退火溫度根據引物的特性設定為60^°C ，延伸時間為30秒，循環數為40個

4.5.2操作流程

首先，對阿膠樣本進行預處理，提取其中的DNA。然后將提取的DNA進行定量，并按照上述反應體系進行DigitalPCR反應體系的配制。將配制好的反應體系加入到DigitalPCR專用芯片中，進行反應。反應結束后，通過特定的儀器軟件進行數據讀取和分析，得到阿膠樣本中目標成分（如羥脯氨酸相關基因片段）的絕對定量結果。

4.6抽取阿膠樣本進行DigitalPCR檢測

4.6.1抽樣方法

采用分層抽樣與隨機抽樣相結合的方法。將阿膠樣本按照產地、生產廠家、批次等因素進行分層。例如，按照產地分為山東產區、河北產區等；按照生產廠家規模分為大型、中型、小型企業生產的阿膠。然后在每個分層中按照一定比例隨機抽取樣本，以確保抽取的樣本具有代表性。

4.6.2樣本數量

考慮到檢測的準確性和成本效益，根據樣本總體的規模確定抽取樣本數量。本實例中，樣本總體數量為500個，按照統計學原理，抽取樣本數量為50個，其中每個分層中的樣本數量根據該分層在總體中的比例進行分配。

4.7檢驗抽取的阿膠樣本

使用DigitalPCR技術對抽取的50個阿膠樣本進行精確的含量定量分析。按照預先設定的技術參數和操作流程進行反應，每個樣本進行三次重復實驗，以減少實驗誤差。將得到的三次結果取平均值作為該樣本的最終檢測結果。

4.8給出阿膠含量是否合格的判斷結論

將每個阿膠樣本的檢測結果與預先設定的質量水平（如羥脯氨酸含量標準范圍及可接受的誤差范圍）進行比較。如果樣本的檢測結果在可接受范圍內，則判定該樣本阿膠含量合格；若檢測結果超出范圍，則判定為不合格。統計合格樣本和不合格樣本的數量，并計算合格率。例如，若有45個樣本的檢測結果在可接受范圍內，則合格率為45÷50×100%=90%

4.9復查

在檢測過程中，如果某個阿膠樣本的檢測結果處于臨界值附近（如羥脯氨酸含量接近標準下限且在誤差范圍邊緣），或者不同次檢測結果存在較大差異（如三次重復實驗結果的RSD超過 10% ），則需要對該樣本進行復查。復查時，重新按照DigitalPCR的操作流程進行檢測，若復查結果仍存在疑問，則考慮采用其他檢測方法（如HPLC-MS）進行驗證，以確保結果的準確性。

4.10阿膠含量定量檢測中引入DigitalPCR的思考 4.10.1技術優勢

DigitalPCR技術在阿膠含量定量檢測中具有明顯的優勢。首先，其高靈敏度能夠檢測到極低含量的目標成分，對于阿膠中微量有效成分的檢測非常關鍵。其次，絕對定量的特性避免了傳統相對定量方法中由于標準曲線制作等因素帶來的誤差，提高了檢測結果的準確性。此外，DigitalPCR對復雜基質（如阿膠這種成分復雜的中藥材）具有較好的適應性，能夠在復雜的成分背景下準確檢測目標成分含量。

4.10.2技術局限性

然而，DigitalPCR技術也存在一些局限性。例如，設備成本較高，需要專業的操作人員進行操作和維護，這在一定程度上限制了其在一些小型檢測機構或企業中的普及應用。同時，DigitalPCR檢測過程相對復雜，檢測時間較長，對于大規模樣本的快速檢測存在一定挑戰。

4.10.3改進方向

為了更好地發揮DigitalPCR在阿膠含量定量檢測中的作用，從以下幾個方面進行改進。一是降低設備成本，通過技術創新或大規模生產降低DigitalPCR儀器的價格，提高其市場競爭力；二是優化操作流程，簡化檢測步驟，縮短檢測時間，提高檢測效率；三是加強技術培訓，提高操作人員的技術水平，確保檢測結果的準確性和可靠性。此外，還進一步研究DigitalPCR技術與其他檢測技術的聯用，充分發揮各自的優勢，為阿膠含量定量檢測提供更完善的解決方案。

5結語

DigitalPCR在阿膠含量定量檢測中的應用展現了其顯著的技術優勢，能夠為確保阿膠產品質量提供更為精準的檢測數據。隨著對中藥材檢測技術要求的不斷提高，采用先進的檢測手段已成為行業發展的必然趨勢。盡管DigitalPCR技術在應用中面臨一些挑戰，但通過技術創新和流程優化，未來有望在阿膠及其他中藥材的檢測中得到更廣泛的應用。為了更好地保障消費者權益和提升市場監管能力，促進DigitalPCR技術的普及與應用將是今后研究的

重要方向。

參考文獻

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（責任編輯：袁文靜）