T₂ mapping對止痛健骨方防治兔膝骨關節炎 關節軟骨衰老療效的監測

EffctmonitoringofZhitongJianguFormulainpreventionandtreatmentofarticularcartilagesenescenceinrabbit knee osteoarthritis by T₂ mapping

GAOHui’，LI Fangli2，YAN Luyoul，ZHANG Kun1.3

'DepartmentofRadiology，First HospitalofHunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410o7，China;Departentof Radiology，Second People's Hospital ofHunan Province，Changsha 4looo7，China; ³ Collegeof Integrated Traditional Chineseand Western Medicine，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 41o2o8，China.

[Abstract]Objective：Toevaluatethe therapeuticefectof Zhitong JianguFormula（ZTJGF）inpreventingandtreating the senescence of articular cartilage in knee osteoarthritis（KOA），and to explore the value of T₂ mapping in monitoring the therapeuticeffect.Methods：AKOAmodelinNewZealandwhiterabitswasproducedbyimmobilizingthekneejointin plasterbandageinfullextension.Acordingtodiferenttreatmentmethods，32NewZealandwhiterabbitswererandomly dividedintothenormalcontrolgroup，themodelcontrolgroup，theZTJGFtreatmentgroup，andtheglucosaminesulfate treatmentgroup，with8rabbitsineachgroup.Aftertwoweeksofimmobilizing，thenormalcontrolgroupandthemodel controlgroupweregiventhesamevolumeof distiledwaterbygavage，whilethe ZTJGF treatmentgroup wasgiven ZTJGF，andtheglucosaminesulfatetreatmentgroupwasgivensulfuricacidandglucosecapsules.After4weeksoftreatment， knee T2mapping was performed on all groups，and the expression of p16^mK4a inarticular chondrocytes wasanalyzed by immunohistochemistry.The diferencesinTvaluesof articularcartilageand p16^mK4a expression among the four groups were compared.The correlationsamong different intervention methods ，T₂ values and p16^uN×4a expression were analyzed. Results ： T₂ valueintheZTJGFtreatmentgroupandtheglucosaminesulfategroup werehigherthanthatinthenormalcontrol group， but lower than thatin the model control group（all Plt;0.05 ）. The p16^uNK4a expression in the ZTJGF treatment group，the glucosamine sulfate group and the normal control group had no differences（ P gt;0.05），but were significantly lower than that in

the model control group（all Plt;0.05 ）.p16 INK4a expression wasnonlinearly related to T₂ value and was slowly increased and then rapidly increased as the T₂ value increased（ Plt; 0.05）．Conclusions：The ZTJGF can prevent and treat the aging of articular cartilage in KOA，and Tmapping can be usedasa non-invasive assessment tool for prevention of cartilage senescence.

[Keywords] Osteoarthritis ；Articular cartilage;Zhitong Jiangu Formula;Magnetic resonance imaging;p16INK4a

骨關節炎是一種常見的慢性非炎癥性骨關節疾病，可引起滑膜關節的結構損傷和功能障礙，是成人疼痛和致殘的主要病因，給家庭及社會帶來沉重的負擔[1-2]。關節軟骨退變是骨關節炎發生及發展的重要因素；而在微觀水平上，軟骨細胞的衰老參與骨關節炎的病理生理過程[3]，其中 p16^INK4a 是衡量軟骨細胞衰老的指標[4-5]。止痛健骨方通絡止痛、活血祛痰、強筋健骨，對膝關節骨性關節炎的關節軟骨損傷具有療效[6。目前評估關節軟骨的手段非常多，其中 T₂ mapping成像技術是臨床上定量分析關節軟骨的無創手段之一，能反映微觀水平上軟骨基質中膠原纖維和水分子含量等生化成分并進行定量分析7]，既可作為膝關節軟骨損傷早期診斷的可靠依據，也可作為評估止痛健骨方治療骨關節炎療效的手段。本研究旨在通過 T₂ mapping成像技術評價止痛健骨方在防治膝骨關節炎軟骨衰老上的可行性，并闡明關節軟骨細胞 p16^INK4a 表達量與定量T值的相關性。

1材料與方法

1.1 實驗動物

選用清潔級的新西蘭大白兔32只，雌雄各半，體質量約 2.2kg ，動物許可證號為SCXK（湘）2015-0008。32只兔適應性喂養1周后隨機分成4組：正常對照組、模型對照組、止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組，每組8只，單籠常規飼養，自由攝食水，且保持 12h 晝夜輪替及恒溫環境。本研究經省中醫藥研究院倫理委員會批準（批號：2017-0021）。

1.2 實驗方法

模型對照組、止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組采用改良伸直位制動法制作膝骨關節炎模型，制動6周[8]。止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組制動2周后開始灌胃。止痛健骨方組給予止痛健骨方：當歸 12g ，黃芪 9g ，白芥子（炒） 12g ，鹿角霜 7.5g ，丹參10.5g ，豬牙皂 1.5g ，鱉甲 7.5g ，乳香（醋制） 7.5g ，沒藥（醋制） 7.5g ，獨活 3Δg ，千年健 9g ，陸英 9g ；依據臨床研究批件規定的制劑工藝及質量監測標準用以上12味藥生產干膏粉以備實驗，生藥量 0.298g/mL 給藥量 10mL?kg^-1?d^-1 （前期藥效學實驗確定的最佳劑量濃度）。硫酸氨基葡萄糖組給予硫酸氨基葡萄糖膠囊（浙江海正藥業，產品批號：GSCy1008），劑量 0.088g?kg^-1?d^-1 （根據人與兔等效劑量公式折算，相當于1倍臨床等效劑量），每日1次，連續4周。正常對照組和模型對照組僅同期灌以相同容積的蒸餾水。

1.3 MRI檢查及圖像處理

灌胃治療4周后均行MRI掃描。采用GE SignaHDxt 3.0T MRI系統、膝關節線圈行兔右后膝關節成像。經耳緣靜脈注射 3% 的戊巴比妥鈉溶液，劑量30mg/kg 體質量，動物麻醉后固定雙膝，并取仰臥位、腿先進。采用冠狀位及矢狀位脂肪抑制FSE-PDWI：TR 1500ms ，TE 30ms ，視野 16cm×16cm ，層厚3mm ，層距 1mm ，矩陣 256×256 ；矢狀位多回波自旋回波 T₂ mapping序列：TR 1100ms ，TE取9、18、27、36、45、54、63、72ms ，視野 16cm×16cm ，層厚 3mm ，層距 1mm ，矩陣 256×256 。

將圖像傳至GE后處理工作站，運用Functool軟件進行后處理，并得到 T₂ mapping偽彩圖，根據冠狀位和矢狀位PDWI三維定位，同時參考大體病理軟骨病變區域確定所需測量的區域，每個區域設置ROI（圖1），重復測量3次后取平均值作為最終結果。設置ROI時需避開周圍的非軟骨區域，并使ROI的形狀和大小一致。

圖1MRI T₂ mapping上股骨內側骨損傷關節軟骨ROI的勾畫示意圖注：根據大體標本確定股骨內側骨關節軟骨損傷最嚴重的區域，測量該區域至股骨內側髁外緣的距離，在冠狀位脂肪抑制PDWI（圖1a雙箭）上確定股骨內側關節軟骨損傷最嚴重的區域（白色虛線），并在對應的矢狀位T₂ mapping偽彩圖（圖1b）上勾畫出股骨內側骨前部關節軟骨的ROI（白色實線）

1.4病理學檢查

MRI掃描后 24h 內，通過空氣栓塞處死所有實驗動物，暴露右膝關節，取膝關節股骨內側髁，通過肉眼觀察股骨內側髁區，確定關節軟骨病變最嚴重的區域，并記錄該區域至股骨內側髁外緣的距離（MRI評估和病理切片時參考）；用 10% 福爾馬林對標本進行固定、脫鈣及石蠟包埋，并對軟骨病變最嚴重區域進行切片，行 p16^INK4a 免疫組化染色，黃色或棕黃色為陽性區域。采用ImageJ軟件計算每高倍視野內陽性細胞的平均光密度值（averageopticaldensity，AOD），選取6個高倍視野，取平均值作為最終結果。

1.5 統計學分析

采用SPSS20.0軟件分析數據。對連續變量先行正態性及方差齊性檢驗，符合正態分布以 表示，組間比較行單因素方差分析；不符合正態分布以M（Q_L，Q_U） 表示，組間比較行Kruskal-Wallis H 或Mann-Whitney U 檢驗。非連續變量則以例 （%） 表示，組間比較行 χ² 檢驗。多因素分析采用最優尺度回歸分析[9]。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.14組性別和體質量比較

實驗過程中6只兔死亡，模型對照組、止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組各2只，最終共26只兔完成實驗。4組動物的性別和體質量差異均無統計學意義（均 Pgt;0.05 （表1）。

表14組動物性別和體質量的比較

注：為 χ² 值，為 F 值。

2.24組關節軟骨 T₂ 值及 p16^INK4a 表達量比較

4組關節軟骨 T₂ 值差異有統計學意義（ Plt; 0.001（表2）；兩兩比較，止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組差異無統計學意義，且均明顯高于正常對照組，低于模型對照組（均 Plt;0.05） （表3，圖2）。4組關節軟骨 p16^INK4a 表達量差異有統計學意義（ （Plt;0.001 （表2）;兩兩比較，正常對照組、止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組差異均無統計學意義（均 Pgt;0.05 ），但均明顯低于模型對照組（均 Plt;0.05 （表3）。

表24組關節軟骨 T₂ 值及 p16^1NK4a 表達量比較 [M（Q_L，Q_U）] 一

注：AOD為平均光密度值。

表34組關節軟骨 T₂ 值及 p16^1NK4a 表達量的兩兩比較

注：AOD為平均光密度值。

2.3 多因素分析

多因素分析采用最優尺度回歸分析，將實驗分組及 T₂ 值作為自變量， p16^INK4a 表達量作為因變量，結果顯示回歸模型有統計學意義（ F=450.356 ， Plt; 0.001）。該模型調整后的決定系數為0.989，提示該模型中約 90% 以上部分可被目前的自變量解釋。實驗分組、關節軟骨 T₂ 值兩者均與關節軟骨細胞p16^mK4a 表達量存在相關性 （Plt;0.05 ），其重要性分別為0.673、0.327，兩者之和 gt;0.999 ，提示上述2個因素占目前模型總解釋度的 99% 以上（表4）。變量轉換后的量化圖顯示： ① 模型對照組軟骨細胞 p16^INK4a 表達量的量化分級高于其他3組，而正常對照組、正痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組之間的軟骨細胞p16^INK4a 表達量的量化分級類似（圖3）； ② 關節軟骨p16^INK4a 表達量隨 T₂ 值的升高，先緩慢升高，再迅速升高，兩者呈非線性關系（圖4）。

圖2 T₂ mapping偽彩圖注：圖 2a～2d 分別為正常對照組、模型對照組、止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組 T₂ mapping偽彩圖， T₂ 值分別為41.57、61.70、51.69、52.88 ms

表4最優尺度回歸模型結果

圖3 p16^?1NK4a 表達量預測模型的實驗分組量化圖注：A組為正常對照組，B組為模型對照組，C組為止痛健骨方組，D組為硫酸氨基葡萄糖組圖4 p16^1NK4a 表達量預測模型的 T₂ 值量化圖

3討論

骨關節炎的發生發展涉及多種結構，包括關節軟骨、軟骨下骨及滑膜等，其中關節軟骨損害是骨關節炎的病理基礎、基本病理變化及首要表現，是當前的研究熱點[10-11]。有研究表明，軟骨衰老在膝骨關節炎軟骨損傷的發生發展中具有重要作用，而 p16^INK4a 是表達于關節軟骨細胞上的一種生物標記，可衡量軟骨細胞衰老[12-13]。MRI功能序列 T₂ mapping可通過定量測量軟骨橫向弛豫時間，提供關節軟骨中細胞外基質水含量、膠原纖維的結構信息及膠原纖維的排列方式，可無創、動態反映骨關節炎關節軟骨的病理改變[14]。本研究通過 T₂ mapping 成像評估止痛健骨方防治膝骨關節炎關節軟骨衰老的療效。

止痛健骨方可在骨關節炎發病機制的多個環節發揮作用[15-16]。本研究模型對照組中軟骨細胞p16^INK4a 表達升高，顯著高于其他3組，提示軟骨細胞衰老參與骨關節炎的發生發展，而止痛健骨方防治骨關節炎的機制之一就是抑制軟骨細胞衰老[17-18]。關節軟骨退變時，MMP-1表達上調，導致關節軟骨基質內Ⅱ型膠原降解、關節軟骨內水含量相應上升，從而導致關節軟骨 T₂ 值升高，而止痛健骨方能降低MMP-1過度表達，引起軟骨基質降解，延緩了關節軟骨內膠原纖維破壞[19]，因此本研究中止痛健骨方組關節軟骨內水含量較模型對照組低。本研究中止痛健骨方組、硫酸氨基葡萄糖組關節軟骨 T₂ 值均明顯低于模型對照組且高于正常對照組，提示 T₂ mapping可作為評估中藥治療骨關節炎療效的指標；另外，關節軟骨細胞 p16^INK4a 表達量隨 T₂ 值先緩慢上升，而后快速上升，兩者呈非線性關系，提示在多種機制參與的骨性關節炎發生發展中， T₂ 值可能具備無創判斷關節軟骨衰老并監測藥物防治療效的潛力。

本研究的局限性： ① 僅選取影像及病理中的1個指標評估關節軟骨損傷，未能充分揭示止痛健骨方在骨關節炎治療中的具體作用機制； ② 盡管止痛健骨方治療骨關節炎的療效得到肯定，但其延緩膝骨關節炎的具體有效成分有待進一步確認。

綜上所述，止痛健骨方可防治膝骨關節炎關節軟骨衰老，且 T₂ mapping可作為藥物防治軟骨衰老的無創評估工具，有助于指導膝骨關節炎的臨床診斷與治療。

[參考文獻]

[1]VOS T，ALLEN C，ARORA M，et al.Global，regional， and national incidence，prevalence，and years lived with disability for 310 diseases and injuries，1990-2015：a systematic analysis for theglobal burden of disease study2015[J].Lancet，2016，388（10053）：1545-1602.

[2]NEOGI T. The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis[J].Osteoarthritis Cartilage，2013，21（9）： 1145-1153.

[3]潘俊康，張義，陳烯琳，等．針刀對膝關節骨關節炎兔軟 骨細胞早衰標志物 p16^lnk4a 和 p21^waf1/Cip1 表達的影響[J]. 針刺研究，2023，48（7）：658-665.

[4]MCCULLOCH K，LITHERLAND G J，RAI T S.Cellular senescence in osteoarthritis pathology[J]. Aging Cell， 2017，16（2）：210-218.

[5]ZHRA M，MAGABLEHA M，SAMHANLM，etal.The expression ofa subset ofaging and antiaging markers following the chondrogenic and osteogenic differentiation ofmesenchymal stem cells of placental origin[J].Cells， 2024，13（12）：1022.

[6]蘇新平，朱克儉，譚旭儀．止痛健骨方對兔膝骨關節炎模 型滑膜及軟骨修復的影響[J].中醫藥大學學報， 2016，36（4）：11-14.

[7]BINKS D A，HODGSON R，RIES M E，et al.Quantita tiveparametric MRI of articular cartilage：a reviewof progress and open challenges[J].Br J Radiol，2013，86 （1023）：20120163.

[8]何業文，范磊，張堃，等．改良伸直位制動法建立兔膝骨 關節炎模型的效果評價［J]．中國中西醫結合影像學雜 志，2020，18（2）：198-200.

[9]張堃，李曼，裴新龍，等．腰椎MR退變征象與慢性下腰痛 關系的最優尺度回歸研究[J]．中華放射學雜志，2014， （12）：1019-1023.

[10］婁思權．骨關節炎的病理與發病因素[J]．中華骨科雜 志，1996，16（1）：56-59.

[11]LOTZ M，MARTELPELLETIER J，CHRISTIANSEN C， et al.Value of biomarkers in osteoarthritis：current statusand perspectives[J]． Ann Rheum Dis，2013，72 （11）：1756-1763.

[12]周昊嵬，婁思權，程愛新，等. p16^mK4a 蛋白在正常及骨關 節炎關節軟骨細胞中的表達及差異分析（英文）[J]．中 國臨床康復，2004，8（11）：2148-2149.

[13] YOON M H，KANG S M，LEE S J，et al. p53 induces senescence through Lamin A/C stabilization-mediated nuclear deformation[J].Cell Death Dis，2019，10（2）： 107.

[14]ROEMER F W，DEMEHRI S，OMOUMI P，et al. State of the art： imaging of osteoarthritis-revisited 2020[J]. Radiology，2020，296（1）：5-21.

[15]PATIL P，DONG Q，WANG D，et al.Systemic clearance of p16^INK4a -positive senescent cellsmitigates ageassociated intervertebral disc degeneration [J]. Aging Cell，2019，18（3）：e12927.

[16]蘇新平，朱克儉，譚旭儀，等．止痛健骨方對兔膝骨關節 炎軟骨IKKα及NF- κB mRNA的影響[J]．中國中醫骨 傷科雜志，2017，25（10）：1-5.

[17]PARK H，LEE H R，SHINH J，et al. p16NK4a-siRNA nanoparticles attenuate cartilage degeneration inosteoarthritisbyinhibitinginflammation in fibroblast-like synoviocytes[J]. Biomater Sci，2022，10（12）：3223-3235.

[18]ANSARI M M，GHOSH M，LEE D S，et al. Senolytic therapeutics：an emerging treatment modality for osteoarthritis[J]. Ageing Res Rev，2024，96：102275.

[19］張堃，朱克儉，譚旭儀，等．MR T₂ mapping成像評估止 痛健骨方治療膝骨性關節炎關節軟骨損傷療效的實驗 研究[J]．中國介入影像與治療學，2017，14（11）：694- 698.

（收稿日期 2024-05-25）