澇漬脅迫對地黃生理生化特性及活性成分的影響

中圖分類號： S567.23Σ⁺4.01 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）11-0118-09

地黃藥材為玄參科植物地黃（RehmanniagutinosaLibosch.）的新鮮或干燥塊根，生地黃味甘、性寒，具有養陰生津、清熱涼血的功效，用于熱病傷陰、舌絳煩渴、溫毒發斑、吐血、蛆血、咽喉腫痛[1]，是著名的“四大懷藥”之一，治療疾病已經有數千年的應用歷史。研究表明，地黃具有抗炎、提高免疫、保護腎臟、降血糖、抗炎和抗骨質疏松等藥理作用，在臨床上應用廣泛[2]。早在1000 多年前，地黃就開始從野生種變為栽培種，在北魏時期的《齊民要術》就記載了“種地黃法”[3]。雖然，地黃野生種和栽培種在分類上被歸為同一種植物，且它們的形態特征極為相似，但在地下塊根的大小上卻存在顯著差異。具體來說，栽培種的塊根明顯膨大，相比之下，野生種的塊根則顯得細小，膨大程度并不顯著，適應環境廣，抗性強。王露等研究發現，栽培地黃在碳水化合物、內源激素等含量方面與野生地黃存在較大的差異[4-5]。澇漬脅迫是影響植物生長發育的一種災害現象，主要是由于長期受地下水浸漬或者地表長期滯水而造成的[。澇漬脅迫分為澇脅迫和漬脅迫，澇脅迫是植物被積水淹沒部分或全部淹沒所造成的危害，而漬脅迫是土壤含水量完全處于飽和狀態下對植物造成的危害。澇漬脅迫影響全球大約 10% 的耕地面積，是農業生產的最重要限制因子之一[7]。澇漬對陸生植物有很大影響，根系由于無法得到充足的氧氣供應而缺氧，缺氧狀況下，植物的呼吸作用受到限制，導致能量和營養物質的供應不足，還可能產生一些有毒代謝物，從而影響植物的生長和發育。地黃喜溫耐旱怕澇，適宜生長在土質疏松、光照充足、氣候溫和的環境中。當突如其來的洪水或連續的降雨導致地黃種植區域遭受嚴重澇災時，這一珍貴的中藥材的產量將受到極大的影響。地黃每年都會因澇害造成或多或少的損失，其中2021年河南“720”特大暴雨災害，造成地黃的產量損失最為顯著，產量初步估計減少30%～40% ，如此嚴重的損失造成地黃市場供不應求，價格不斷上漲。因此，該事件發生之后引起了人們對地黃生產過程中遭受澇害脅迫問題的強烈重視。

因此，本研究以膨大期野生地黃和栽培地黃品種沁懷為供試材料，采用可控的土盆栽培模擬澇漬脅迫，探究地黃澇漬脅迫下的表型變化、生理特性及代謝變化關系，為地黃的抗逆品種選育以及地黃水淹災后生產指導提供關鍵的理論支撐

1材料與方法

1.1 試驗材料

栽培地黃種質選用沁懷為試驗材料，野生地黃種質采挖自野外生長的地黃，表現為塊根不膨大；試驗所用土壤為沙壤土，取自試驗田中未種植過地黃的土壤。地黃盆栽種植選用大小相似的種質進行繁殖，試驗用花盆尺寸為內徑 20cm ，高 19.3cm 栽培時土壤與盆口齊平，進行常規的栽培管理至塊根膨大中期，選用長勢一致的地黃進行試驗處理。

1.2 試驗方法

試驗于2023年10月19日在河南中醫藥大學藥用植物園進行。澇漬脅迫依據地黃在栽培過程中遇到的“漬”和“澇”問題，設置3個梯度，分別為對照、漬處理和澇處理。對照組：土壤含水量控制在田間持水量的 60% 左右；漬處理：土壤含水量完全處于飽和狀態，并隨時補充水分；澇處理：將花盆放在水箱中，根部土壤全部浸入水中，水位超過花盆口 1～2cm ，每天查看水箱內的水位情況，及時補充水分到設定的水位線。試驗用水均為自來水，其他常規管理皆一致。處理后每隔1d進行表型觀察、指標測量和取樣。不同供試材料的相同指標均在08：30—10：30采樣，取地黃中間成熟葉片和塊根用于相關指標測定，每個處理3次重復。

1.3 測定指標與方法

1.3.1生長形態指標的觀察、測定生長形態指標主要包括地黃植株的生長形態描述、塊根活力。在處理后 1d（24h） 和3d（ 72h 觀察3組地黃的形態，包括其葉片卷曲或萎蔫程度，并拍照記錄。塊根的活力測定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法8]。

1.3.2酶活生理指標的測定處理后1d和3d取地黃中間成熟葉片和塊根，每個處理3次重復。葉片游離脯氨酸（Pro）含量的測定采用芘三酮法[9]；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）法[9]；過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）的活性采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定。

1.3.3滲透調節物質指標測定可溶性糖的含量采用蒽酮比色法測定，具體試驗方法參考《植物生理生化實驗原理和技術》[9]

1.3.4光合色素指標測定光合色素包括總葉綠素、類胡蘿卜素、葉綠素a和葉綠素b，它們的含量采用 80% 丙酮浸提，利用紫外分光光度計比色法測定。總葉綠素含量 σ=σ 葉綠素a含量 + 葉綠素b含量。

1.4地黃代謝組檢測與分析

1.4.1高效液相色譜法（HPLC）色譜條件代謝組學的檢測采用高效液相色譜儀（Waters），色譜柱為Agilent5TC-C18，內徑為 4.6mm ，柱長 250mm ：樣品放置于凍干機（Scientz-100F）中真空冷凍干燥；利用研磨儀（MM40，Retsch）研磨至粉末狀;地黃苷D高效液相色譜法參數設定：波長為 203nm ，流動相乙腈：水體積比為 10：90 ;流速 1.0mL/min 柱溫： 30% 。梓醇高效液相色譜法參數設定：波長為 210nm ，流動相乙腈：水體積比為 5：95 ；流速1.0mL/min ；柱溫： 30% 。

1.4.2地黃樣品溶液與標準品溶液的制備地黃樣品制備：精確稱定，置于具塞錐形瓶中，加入 25% 甲醇，稱重，超聲（功率400W，頻率 50kHz ）處理1h，放冷，再稱重，用 25% 甲醇補足減失的重量，搖勻，高速離心 10min ，取上清液濾過，取續濾液，即得。標準品溶液制備：取地黃苷D標準品適量，精確稱定，加 25% 甲醇制成每 1mL 含 1mg 的溶液，即得。取梓醇標準品適量，精確稱定，加流動相制成含量為 1mg/mL 的溶液，即得。

1.4.3樣品活性成分含量測定與計算取樣品濾液，根據\"1.4.1\"節色譜條件分別重復進樣3次，計算結合標準曲線，得到地黃苷D和梓醇的活性成分含量。

1.4.4線性關系的考察取地黃苷D標準品溶液，精確吸取適量溶液于容量瓶中，經 25% 甲醇稀釋，配制成濃度分別為31.33、62.67、125.30、188.00、251.00、313.30、470.00mg/L的標準液；精確稱取梓醇標準品，依次制成35、350、700、1400、2100、2800、3500mg/L 的標準液，濃度由低到高進行測定。以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標進行線性回歸。

1.4.5重復性考察平行制備6份樣品溶液，計算各活性成分峰面積的相對標準偏差（RSD）值。

1.4.6精密度試驗取供試品溶液，連續進樣6次。計算各活性成分峰面積RSD值。

1.4.7穩定性試驗取樣品溶液，在制備后0、2、4.6，8，10，12，24h 分別進行測定。計算地黃苷D和梓醇峰面積的RSD值。

1.4.8加樣回收率試驗取6份已知含量的相同樣品，每份 _0.1g ，再精確加入適量地黃苷D、梓醇標準品，按照“1.4.1”節色譜條件測定并計算。

2 結果與分析

2.1生長形態指標的觀察、測定

2.1.1澇漬脅迫對地黃植株形態的影響由圖1可知，野生地黃經過澇漬處理后1d葉片無明顯變化，澇處理葉片相較于CK和漬處理葉片褪綠變黃；處理3d后，漬處理葉片有少許變黃、腐爛，澇處理葉片明顯變黃，且有少量枯葉腐爛掉落。栽培地黃經過澇漬處理1d后，漬處理相較于CK變化不大，澇處理與CK相比，葉子卷曲、腐爛；處理3d后，有多片葉片卷曲腐爛。

2.1.2澇漬脅迫對地黃根系活力的影響根系是植物吸收運輸水分和養分的器官，是體現植物生長活躍度的重要指標[10]。由圖2可知，栽培地黃的根系活力隨著澇漬脅迫時間的延長而下降，澇處理的降幅明顯高于漬處理;處理1d時，栽培地黃漬處理和澇處理的根系活力相較于CK分別顯著下降22.02% 和 27.27% （ Plt;0.05） ；處理3d時，漬處理和澇處理根系活力分別較處理1d時下降 26.79% 和 39.06% ，相較于CK顯著下降44. 55% 和56.96% 。處理1d時，野生地黃漬處理和澇處理相較于CK根系活力分別上升 22.32% 和下降40.59% ；漬處理和澇處理3d時的根系活力較處理1d時分別上升 72.50% 和下降 18.14% ，較于CK分別顯著上升 149.41% 和顯著下降 29.68% 。說明澇漬脅迫會嚴重影響栽培地黃根系的生長發育，而適當的漬處理則會使野生地黃根系活力增加；栽培地黃的根系相對于野生地黃的根系來說抗澇漬能力較弱。

2.2澇漬脅迫對地黃酶活生理指標的影響

2.2.1超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化SOD是廣泛存在于植物、動物和微生物體內的一種清除超氧陰離子自由基的酶，是清除ROS的第一道防線，催化超氧化物的歧化反應[11]。SOD 的活性與植物抗逆性存在密切的聯系，并且它的調節受到外源激素的影響[12]。從圖3可以看出，隨著脅迫時間的延長，野生地黃與栽培地黃SOD活性呈現逐漸上升的變化趨勢，澇處理的SOD活性顯著高于漬處理。其中，處理3d時，澇處理栽培地黃根的SOD活性相較于CK顯著上升 146.92% ，漲幅最高。2.2.2過氧化氫酶（CAT）活性測定CAT是清除植物代謝過程中產生的過氧化氫，從而保護植物細胞的一種酶[13]。由圖4 可知，栽培地黃葉隨著脅迫程度的加深，CAT活性均呈下降趨勢。野生地黃根中隨著脅迫時間的延長和程度的加深，CAT活性呈現逐漸上升的趨勢。野生地黃葉漬處理和澇處理1d的CAT活性較CK呈現顯著下降趨勢；澇處理3d的CAT活性較CK顯著上升，增幅為 93.88% ，而漬處理則顯著下降。

2.2.3過氧化物酶（POD）活性測定POD是維持細胞結構完整性的氧化還原酶，廣泛存在于植物體內，主要作用為增強細胞的抗衰老能力以及對抗逆境脅迫[14]。由圖5可知，栽培地黃根漬處理和澇處理的POD活性均顯著高于CK，漬處理1d的漲幅最大，較CK顯著增加 82.29% 。栽培地黃葉隨著澇漬處理時間的延長，POD活性有所增加。處理1d時，野生地黃根澇處理的POD活性最高，而處理3d時則是漬處理最高，較CK顯著增加 106.62% 。野生地黃葉經澇漬脅迫后，漬處理POD活性呈現顯著上升趨勢，處理13d分別較CK增加 22.34%.27.54% 。

2.3澇漬脅迫對地黃滲透調節物質的影響

2.3.1可溶性糖含量測定可溶性糖是植物體內可利用碳水化合物之一，可溶性糖的含量在一定程度上反映植物的碳代謝水平[15]。由圖6可知，栽培地黃根和野生地黃的根、葉隨著澇、漬脅迫時間的延長和脅迫程度的加深，可溶性糖含量均呈現上升趨勢。處理1d時，栽培地黃根漬、澇處理的可溶性糖含量較CK分別顯著上升 6.48% 、 19.61% ；漬處理和澇處理3d時相較于1d分別上升 0.30% 、

4.96% ;栽培地黃葉澇處理1d時相較于CK顯著增加 27.85% ，處理3d相較于處理1d增加 2.62% ;漬處理 與CK均無顯著差異。野生地黃根漬處理和澇處理1d的可溶性糖含量相較于CK分別顯著增加 15.04% 和 19.32% ，處理3d的可溶性糖含量相較于1d分別增加 1.04% 和 3.15% 。野生地黃葉漬處理和澇處理1d相較于CK分別顯著增加 7.46% 和 41.18% ，處理 3d 相較于處理1d可溶性糖含量分別升高 14.60% 和 2.74% 。總體來看，根的可溶性糖含量大于葉。綜上可知，當脅迫發生時，地黃能通過積累可溶性糖的含量來抵抗澇、漬脅迫[15] 。

2.3.2脯氨酸（Pro）含量測定Pro是環境脅迫條件下細胞內的保護物質，其含量與多數植物的脅迫耐受能力呈正相關關系[16]。由圖7可知，栽培地黃根經澇、漬處理1d后 Pro 含量較CK顯著增加，處理3d時漬處理的Pro含量最高，較CK顯著增加117.37% 。栽培地黃葉經澇、漬處理1d后 Pro 含量顯著上升，其中澇處理含量最高，較CK增加 156.26% ，澇處理3d的Pro含量較處理1d下降 72.59% 。野生地黃根和野生地黃葉隨著澇、漬脅迫時間的延長和程度的加深，Pro含量呈現逐漸上升的趨勢。

2.4澇、漬脅迫對地黃光合色素指標的影響

葉綠素是植物進行光合作用的必要組成，葉綠素的缺乏將會導致植物光合能力下降，不利于植物生長發育。由圖8可知，隨著脅迫時間的延長，栽培地黃葉的葉綠素含量在漬脅迫、澇脅迫處理下均逐漸降低；而野生地黃葉的葉綠素含量卻逐漸升高。澇處理下，野生地黃葉的葉綠素含量明顯高于栽培地黃葉。與CK相比，澇、漬處理的地黃葉葉綠素含量均顯著降低，說明在澇漬逆境脅迫下，葉綠素遭到了大量破壞，其含量顯著下降。

2.5澇、漬脅迫對地黃代謝活性成分含量的影響

2.5.1線性考察地黃活性成分標準曲線如表1

所示，地黃苷D與梓醇回歸方程均滿足 r²gt;0.999 ，表明在線性范圍內地黃苷D、梓醇含量與標準液濃度呈現良好的線性關系。

2.5.2重復性考察平行制備6份樣品溶液，地黃苷D、梓醇RSD值分別為 2.15%.1.14% ，表明本方法重復性好。

2.5.3穩定性試驗取樣品溶液，在制備后0、2、4，6，8，10，12，24h 分別進行測定。計算出地黃普D和梓醇峰面積的RSD值分別為 1.21%.1.58% 。表明樣品在 24h 內基本穩定。

2.5.4精密度試驗取供試品溶液，連續進樣6次。計算得到地黃苷D、梓醇峰面積 RSD 值分別為2.25% .1.72% ，表明儀器精密度良好。

2.5.5加樣回收率試驗地黃中活性成分加樣回收率見表2，地黃苷D和梓醇平均回收率分別為100.45% 和 100. 15% ， RSD 值分別為 0.21% 和0.36% ，表明該方法準確可靠。

2.5.6地黃樣品活性成分含量由圖9可知，漬處理和澇處理后，經HPLC測定發現，地黃中代謝活性成分地黃昔D與梓醇含量的變化趨勢總體類似。栽培地黃根中，澇漬脅迫后的地黃昔D和梓醇含量與CK相比均顯著降低。野生地黃根與栽培地黃根

趨勢相反，在脅迫后呈現含量顯著上升的趨勢（澇處理3d除外）。栽培地黃葉中，地黃苷D和梓醇的含量與CK相比呈現顯著上升趨勢，但處理3d與處理1d相比含量下降。野生地黃葉中地黃苷D含量與CK相比均呈顯著上升趨勢，但漬處理3d的含量與處理1d相比上升，澇處理含量則下降;梓醇含量澇、漬處理相較于CK呈現上升趨勢，澇處理1、3d顯著高于相應漬處理。

3討論

澇漬脅迫是影響植物生長發育及農業生產的重要逆境脅迫方式之一，澇漬下植物體內活性氧清除酶系統活性下降，膜脂過氧化產物增多，氧化壓力升高，植物衰老加快是植物遭受澇害的表現之_[17-19]。植物遭受澇漬逆境脅迫后為了適應生長，其自身表觀形態、生理生化指標及代謝成分都會有相應的變化[20]。澇、漬脅迫下，野生地黃與栽培地黃根、葉的SOD活性較CK顯著增加，澇處理相對于漬處理也顯著增加。栽培地黃根和野生地黃根的POD活性澇、漬處理顯著高于CK，隨著脅迫時間的延長，栽培地黃根漬處理POD活性有所下降；栽培地黃葉澇、漬處理的POD活性小于CK;野生地黃葉漬處理1、3d的POD活性均顯著高于相應澇處理。野生地黃根、葉澇處理的CAT活性顯著高于漬處理，栽培地黃根在處理1d時隨著脅迫程度的加深，CAT活性呈現逐漸上升的趨勢，而在處理3d時呈現不斷下降的趨勢，栽培地黃葉隨脅迫程度加深，CAT活性不斷下降。這與方文對紅花玉蘭的研究結果[21]一致。綜上所述，植物在受到脅迫后，會啟動自身保護機制。在這個過程中，植物體內的

POD、SOD、CAT等酶會配合作用，共同清除因脅迫而產生的活性氧，以減少膜系統的損傷，進而增強植物的抗澇性。并且這種抗氧化酶的活性隨著地黃抗澇漬能力的大小而改變，由這些抗氧化酶活性變化得出，野生地黃抗澇漬能力明顯大于栽培地黃。

滲透調節是植物在面對逆境脅迫時采取的一種關鍵自我防護機制。可溶性糖和脯氨酸作為植物細胞內的重要滲透調節物質，在細胞內大量積累能維持細胞較高的滲透壓，有助于穩定質膜結構，增強細胞的耐脫水能力，從而提高植物對逆境脅迫的耐受性[22-23]。栽培地黃根、葉以及野生地黃根、葉隨著澇脅迫、漬脅迫時間的延長，可溶性糖含量均呈現上升的趨勢，這與周鑫等關于楨楠幼樹的研究結果[24]一致。栽培地黃根和葉澇處理3d時脯氨酸含量都有所降低。以上結果表明，栽培地黃抗澇能力弱于野生地黃。

葉綠素是植物進行光合作用不可或缺的組成部分，若植物體內葉綠素含量不足，將會嚴重削弱其光合能力，從而對植物的生長發育產生不利影響。野生地黃和栽培地黃葉綠素含量隨著脅迫程度的加深和時間的延長不斷降低，劉曉慧等研究發現，澇、漬脅迫也會導致絲瓜幼苗葉綠素含量顯著下降[15]

地黃苷D和梓醇是地黃中重要的活性成分，經HPLC測定發現，經澇漬處理后，栽培地黃根中地黃苷D和梓醇含量顯著低于CK，而野生地黃根中含量顯著高于CK（澇處理3d除外），漬脅迫含量最高。澇、漬處理栽培地黃葉和野生地黃葉的地黃苷D含量、梓醇含量均顯著高于CK。野生地黃的活性成分含量高于栽培地黃。以上含量變化表明，栽培地黃澇漬脅迫后活性成分含量減少，可能是本研究的脅迫已經超出了地黃的適宜逆境；而對野生地黃來說，澇漬脅迫能提高其活性成分含量，表明適當的逆境脅迫可以提高地黃中藥活性成分的含量。

4結論

本研究初步探索地黃在澇、漬脅迫下的生理響應機制，其中，SOD活性、POD活性、CAT活性、脯氨酸含量等指標結果顯示，野生地黃抗澇漬能力明顯大于栽培地黃;經HPLC測定，栽培地黃在澇漬脅迫下地黃苷D與梓醇含量整體呈下降趨勢而野生地黃呈上升趨勢，且野生地黃含量高于栽培地黃。總體上，野生地黃相比栽培地黃對澇漬脅迫具有更高的抗性，但為了更深人地揭示地黃響應澇漬脅迫的根本原因，還需從分子層面進行深入研究，為地黃篩選抗澇漬的分子育種策略奠定科學基礎。

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