hTERT siRNA對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖及化療敏感性的影響

牛高麗，溫玉庫

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，全世界每年有250 000例婦女死于宮頸癌［1］。2010年12月～2011年6月，我們觀察了靶向人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)siRNA對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖及化療敏感性的影響，旨在為宮頸癌的基因治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 Hela細(xì)胞，RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清，EntransterTM-R轉(zhuǎn)染試劑盒，Trizol Reagent，cDNA合成及RT-PCR試劑盒，兔抗人hTERT單克隆抗體，兔抗人 β-actin單克隆抗體，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體，3-(4，5-二甲基-2 噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)，胰蛋白酶，青/鏈霉素，順鉑，博來霉素，DMSO;hTERT化學(xué)合成siRNA序列參照文獻設(shè)計，經(jīng)廣州銳博生物技術(shù)公司合成。正義鏈:5'-GGCACTGTTCAGCGTGCTCTT-3';反義鏈:3'-GAGCACGCTGAACAGTGCC-5';Control siRNA序列:正義鏈:5'-CCGTCGACGCGTACTTGGTTT-3';反義鏈:3'-CGGTCCAGAGCATCAACGG-5'［2］。

1．2 實驗方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Hela細(xì)胞貼壁生長于含10%胎牛血清，1%青/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞按1×106/孔接種于6孔培養(yǎng)板，待貼壁率達60%左右時將細(xì)胞分為 hTERT siRNA組、Control siRNA組、空載體組及空白細(xì)胞組，以新型納米載體EntransterTM-R作為轉(zhuǎn)染試劑，按試劑說明將hTERT siRNA、Control siRNA及空載體分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染siRNA終濃度為50 nmol/L。培養(yǎng)4～6 h后更換RPMI1640完全培養(yǎng)基，分別于24、48 h后收集細(xì)胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1．2．2 hTERT mRNA表達檢測 采用 real time-PCR法。于轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計hTERT引物:5'-CATCGCCAGCATCATCAAACCC-3'，5'-AGGTCTGTCAAGGTAGAGACGTG-3'。內(nèi)參照基因 3磷酸甘油醛(GAPDH)引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司合成。使用SYBRGreen作為熒光染料，F(xiàn)ITC2000實時熒光定量基因擴增儀進行檢測，擴增條件:94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72℃30 s，30個循環(huán)。參照文獻報道取 Ct(cycle thresh-old)值［3］。計算△Ct=Ct(目的基因)－ Ct(GAPDH)，再將各實驗組樣本的△Ct減去正常對照的△Ct，即得△△Ct。結(jié)果以 2-△△Ct表示。

1．2．3 hTERT蛋白表達檢測 采用 Western blot法。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞消化離心，以蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，冰上裂解3 h，取變性蛋白樣品20 μg進行SDS-PAGE蛋白電泳，通過電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h。按1∶2 000比例加入兔抗hTERT單克隆抗體(一抗)置于脫色搖床上孵育2 h，TBST液洗3次，各10 min。HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(二抗)1∶5 000置于脫色搖床上孵育1 h，TBST液洗3次，各10 min，加顯色劑，入暗室曝光、顯影，圖像掃描并以Image J軟件進行灰度分析得出灰度值。以β-actin蛋白作為內(nèi)參照。

1．2．4 細(xì)胞增殖活性測定 采用MTT法。取各組細(xì)胞以1×104個/孔接種于96孔板，每組設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 和96 h 時孔內(nèi)各加入 10 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0．5%MTT)，培養(yǎng)4 h 后去除培養(yǎng)液，加入 DMSO 150 μl/孔，振蕩 10 min，充分溶解結(jié)晶。于酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長下測定各孔光吸收(A)值，以此表示細(xì)胞增殖活性。

1．2．5 化療敏感性試驗 各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別用不同質(zhì)量濃度順鉑、博來霉素處理，順鉑(1 mg/ml)至終質(zhì)量濃度為 0．02、0．1、0．5、2．5、12．5 μg/ml，博來霉素(1 mg/ml)至終質(zhì)量濃度為 0．01、0．1、1、10、100 μg/ml，以空白細(xì)胞作為對照，每組設(shè)4個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μl MTT溶液，37 ℃ 孵育 4 h，棄上清，加入 150 μl DMSO，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶，選擇490 nm波長，測定光吸收值(A490)，以此計算細(xì)胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。用IC50計算軟件得出細(xì)胞的半數(shù)生長抑制濃度(IC50)。

1．3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16．0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，率的比較采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 hTERT mRNA、hTERT蛋白表達 見表1。由表1可見，hTERT siRNA作用Hela細(xì)胞24、48 h后，hTERT mRNA及蛋白表達均明顯降低，和空白細(xì)胞組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。而Control siRNA組、空載體組與空白細(xì)胞組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0．05)。

表1 各組hTERT mRNA、hTERT蛋白表達(±s)

表1 各組hTERT mRNA、hTERT蛋白表達(±s)

注:與空白細(xì)胞組比較，*P＜0．05

組別 hTERT mRNA(2-△△Ct)hTERT 蛋白(灰度值)hTERT siRNA 組 0．47 ±0．02* 1．36 ±0．27*Control siRNA 組 0．98 ±0．09 2．86 ±0．09空載體組 0．94 ±0．11 2．61 ±0．18空白細(xì)胞組1．00 2．79 ±0．16

2．2 細(xì)胞增殖活性 Control siRNA組、空載體組及空白細(xì)胞組增殖速度相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)，而hTERT siRNA組細(xì)胞增殖速度明顯減慢，隨時間增加而增加，表明靶向hTERT的siRNA使細(xì)胞生長受到抑制，見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖活性(±s)

表2 各組細(xì)胞增殖活性(±s)

注:與空白細(xì)胞組比較，*P＜0．05

組別24 h 48 h 72 h 96 h hTERT siRNA 組0．419 ±0．021*0．645 ±0．013*0．772 ±0．019*0．869 ±0．007*Control siRNA 組0．578 ±0．018 0．941 ±0．005 1．118 ±0．012 1．159 ±0．009空載體組 0．607 ±0．023 0．901 ±0．014 1．149 ±0．026 1．153 ±0．033空白細(xì)胞組 0．597 ±0．011 0．906 ±0．022 1．239 ±0．034 1．183 ±0．016

2．3 抑制hTERT基因?qū)ela細(xì)胞化療敏感性的影響 順鉑及博來霉素作用后的細(xì)胞存活率分別見圖1、圖2。由圖可見，與其他各組比較，同一藥物濃度時hTERT siRNA組細(xì)胞存活率最低(P＜0．05)。hTERT siRNA 組順鉑的 IC50為(2．19 ±0．02)μg/ml(P＜0．05)，Control siRNA 組、空載體組及空白細(xì)胞組IC50均無顯著差異(P ＞0．05)，分別為(8．11 ±0．03)、(7．47 ± 0．28)、(7．94 ± 0．12)μg/ml。hTERT siRNA 組博來霉素的 IC50為(7．39 ±0．45)μg/ml，Control siRNA組、空載體組及空白細(xì)胞組分別為(99．08 ± 0．56)、(94．27 ± 0．35)、(98．17 ±1．05)μg/ml，hTERT siRNA 組兩藥的 IC50值均明顯低于其他各組，P＜0．05;另三組間兩藥的IC50值比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 Hela細(xì)胞對順鉑的敏感性試驗

圖2 Hela細(xì)胞對博來霉素的敏感性試驗

3 討論

端粒是位于真核生物染色體3'末端的一段富含G的DNA重復(fù)序列，對于維持基因的穩(wěn)定性起重要作用，端粒酶可使端粒保持穩(wěn)定的長度，而hTERT是端粒酶活性的主要限速因子［4］。以往研究證實，端粒酶的激活在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)時即可檢測到端粒酶的表達，宮頸癌時其表達程度更高;端粒酶激活可能是宮頸癌變中的早期事件［5］。因此，hTERT是一個理想的治療癌癥的靶向目標(biāo)，抑制hTERT的表達能明顯抑制細(xì)胞增殖。抑制端粒酶活性的方法較多，包括反義核苷酸技術(shù)，核酶及一些小的合成分子［6］。RNA干擾是存在于植物和哺乳動物細(xì)胞中一種天然的基因沉默保護機制，siRNA可以特異性靶向mRNA使其降解從而阻止目的蛋白的表達，具有高效、特異、無毒等特點，因此設(shè)計靶向hTERT的siRNA能成為治療腫瘤的一種方法。本研究發(fā)現(xiàn)，hTERT siRNA可抑制宮頸癌 Hela細(xì)胞中hTERT mRNA及蛋白水平的表達，細(xì)胞增殖受到抑制并隨時間增加而增加，提示靶向hTERT的siRNA能抑制目的基因表達并抑制細(xì)胞生長。

順鉑是宮頸癌最基本的化療藥物之一，其可與DNA形成鏈內(nèi)交聯(lián)，抑制DNA合成，并通過caspases途徑促進細(xì)胞凋亡［7］。而博來霉素可致DNA鏈的斷裂，屬于G2期特異性藥物，是新輔助化療中主要聯(lián)合用藥之一。據(jù)報道，化療治療宮頸癌的有效率大約為50%，且存在耐藥及副作用，對于體積較大、復(fù)發(fā)的腫瘤總體治療效率低。本研究發(fā)現(xiàn)，各組細(xì)胞存活率均隨順鉑、博來霉素濃度的增加而降低，hTERT siRNA組細(xì)胞增殖活性明顯低于其他各組，IC50濃度顯著降低，提示hTERT siRNA可增強宮頸癌Hela細(xì)胞對化療藥物的敏感性。目前研究顯示，細(xì)胞中hTERT與DNA修復(fù)過程有直接的關(guān)聯(lián)，hTERT的異常表達促進了DNA的修復(fù)，可能與增強了與DNA修復(fù)相關(guān)的幾個基因的表達有關(guān)，包括Rad51、hMLH1、hMSH6 等［8］，抑制 hTERT 表達可能增強了順鉑及博來霉素導(dǎo)致的DNA斷裂作用。因此，我們認(rèn)為將hTERT抑制與化療藥物聯(lián)合使用可能有更好的效果。

總之，靶向hTERT設(shè)計的siRNA可明顯抑制宮頸癌Hela細(xì)胞中hTERT表達，抑制細(xì)胞生長，并增強化療藥物的敏感性，可能為宮頸癌的治療提供新的方向。

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