乙酰肝素酶在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

姜維華 朱辛明 楊志平 朱 晴 馬春園 黃宇鵬 林明軒

(北華大學附屬醫院，吉林 吉林 132001)

腫瘤侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要表現之一，細胞外基質(ECM)和基底膜(BM)構成腫瘤轉移的重要屏障。近年來研究發現，乙酰肝素酶(Hpa)可特異性降解ECM和BM的主要成分——硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteogly-can，HSPG)，并且協同多種因子直接和間接地促進腫瘤的侵襲和轉移〔1〕。Hpa在多種惡性腫瘤中表達水平高于其來源的正常組織，但胃癌(GC)組織中Hpa表達研究較少。本實驗研究GC患者術后癌組織標本中Hpa的表達狀況，分析Hpa表達與臨床病理因素的關系，并探討其在GC侵襲和轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 收集北華大學附屬醫院病理科2009～2010年手術切除的胃腺癌石蠟包埋標本60例，其中男52例，女8例;年齡32～79歲，中位年齡52歲。所有病例術前均未行放、化療，且均經病理學診斷證實。按照WHO對GC的分級標準，高分化5例，中分化18例，低分化37例;按照1997年國際抗癌聯盟(UICC)TNM分期法(第5版)進行分期:Ⅰ+Ⅱ期34例，Ⅲ+Ⅳ期26例;有淋巴結轉移32例，無淋巴結轉移28例;10例距腫瘤組織5 cm以上的正常組織作為對照。

1.1.2 主要試劑 Hpa兔抗人多克隆抗體，購于博士德生物有限公司。鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購于北京中山生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 4 μm厚石蠟切片，采用SP連接免疫組織化學方法檢測Hpa蛋白的表達。用已知陽性的GC切片作陽性對照，已知陰性的GC切片作陰性對照。用已知陽性的GC切片，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作空白對照。

1.2.2 結果判定 參照Kawasaki〔2〕和 Sinicrope〔3〕的半定量積分方法判斷結果:乘積法計算結果:0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性()，9～12分為強陽性()。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計數資料的比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 Hpa蛋白陽性表達的分布特點 鏡下Hpa蛋白陽性染色位于腫瘤細胞質內，為黃色到深棕黃色顆粒。正常胃黏膜偶見表達。見圖1。

2.2 Hpa在GC與正常組織中的表達情況 Hpa在對照組正常胃組織中見1例陽性表達，而在60例GC組織中有40例呈陽性表達，陽性率為66.7%，較對照組明顯升高，差異顯著(P ＜0.05)。

2.3 GC中Hpa與臨床病理參數的關系 Hpa蛋白及在GC中的表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑無關(P＞0.05)。Hpa在高+中分化組陽性表達12例，陽性率52.2%(12/23);低分化組28例陽性，陽性率75.7%(28/37)，差異具有統計學意義(P＜0.05)。Hpa在淋巴結轉移組陽性表達25例，陽性率78.1%(25/32);未轉移組陽性表達15例，陽性率53.6%(15/28)，差異具有統計學意義(P＜0.05)。Hpa在Ⅰ+Ⅱ組陽性表達19例，陽性率 55.9%(19/34)，Ⅲ +Ⅳ組 21例，陽性率80.7%(21/26)，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

圖1 Hpa蛋白陽性表達分布特點(SP法)

表1 Hpa與GC患者病理參數的關系〔n(%)〕

3 討論

Hpa在人類正常組織中的表達主要限于胎盤和淋巴器官，而在結締組織細胞和大多數正常上皮中極少或無表達〔4，5〕。Hpa促進腫瘤轉移最直接的證據是Voldavsky小組基因轉染實驗〔4〕，他們通過載體將Hpa cDNA分別導入無轉移潛力的小鼠淋巴瘤擬胚體(EB)細胞系和低轉移潛力的黑色素瘤細胞系，結果轉染細胞均有高水平Hpa表達，并獲得高轉移潛能，經裸鼠靜脈接種后大體標本和顯微鏡檢查均發現轉染組有明顯肝轉移灶，而假轉染組僅鏡檢才發現肝竇等處有癌細胞;至4 w時，對照組所有小鼠均存活，而實驗組已有50%死亡，其中90%死于轉染后34 d之內。

本實驗10例正常組織中也可見1例陽性表達，與Elkin等〔6〕報道的Hpa蛋白在乳腺癌中的表達相一致。提示了Hpa的高表達可能促進了GC細胞的增殖。在本組60例腫瘤組織中，Hpa表達的陽性率為66.7%，與 Takaoka〔7〕發現 Hpa在 GC中的陽性表達率79.5%(35/44)結果接近。提示Hpa與GC的發展有密切關系，說明癌旁黏膜上皮中的這些Hpa陽性細胞已具有進一步發展為癌的潛能(不論其有無可見的形態改變)，并可能發生克隆性無限增殖直至惡變。而且Hpa傾向于在下列組織中表達:(1)組織分化較好者;(2)有淋巴結轉移者;(3)晚期GC者。研究結果表明，Hpa的表達與反映侵襲、轉移潛能和預后的組織病理學指標有顯著相關性。目前的研究認為，組織分化程度、淋巴結轉移和TNM分期是GC獨立的預后指標〔1，8〕。

1 Chen JQ，Zhan WH，He YL，et al.Expression of heparanase gene，CD44v6，MMP-7 and nm23 protein and their relationship with the invasion and metastasis of gastric carcinomas〔J〕.World J Gastroenterol，2004;10(6):776-82.

2 Kawasaki H，Altieri DC，Lu CD，et al.Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer〔J〕.Cancer Res，1998;58(22):5071-4.

3 Sinicrope FA，Ruan SB，Cleary KR，et al.Bcl-2 and p53 on coprotein expression during colorectal tumorigenesis〔J〕.Cancer Res，1995;55(2):237-41.

4 Vlodavsky I，Friedmann Y，Elkin M，et al.Mammalian heparanase:gene cloning，expression and function in tumor progression and metastasis〔J〕.Nat Med，1999;5(7):793-802.

5 Hulett MD，Freeman C，Hamdorf BJ，et al.Cloning of mammalian heparanase，an important enzyme in tumor invasion and metastasis〔J〕.Nat Med，1999;5:803-9.

6 Elkin M，Cohen I，Zcharia E，et al.Regulation of heparanase gene expression by estrogen in breast cancer〔J〕.Cancer Res，2003;63(24):8821-6.

7 Takaoka M，Naomoto Y，Ohkawa T，et al.Heparanase expression correlates with invasion and poor prognosis in gastric cancers〔J〕.Lab Invest，2003;83(5):613-22.

8 Shiraishi N，Inomata M，Osawa N，et al.Early and late recurrence after gastrectomy for gastric carcinoma.Univariate and multivariate analysis〔J〕.Cancer，2000;89(2):255-61.