農桿菌滲透法轉化煙草條件的優化

李曉君　王紹梅　謝艷蘭　和敏

摘要：植物瞬時表達系統常用于研究基因表達產物的亞細胞定位和蛋白間的互作，將GFP-GUS融合蛋白植物表達載體導入農桿菌EHA105，獲得工程菌，制備不同濃度的農桿菌浸染液，用注射法對煙草葉片進行轉化，熒光顯微鏡檢測煙草葉片原生質體和下表皮中GFP的表達情況。結果表明，浸染注射液的D600 nm 在0.3～0.7之間均具有較高的轉化效率，注射后第4天至第6天為較佳觀察時間。

關鍵詞：植物瞬時表達系統；滲透法；轉化；農桿菌滲透注射；煙草；綠色熒光蛋白（GFP）

中圖分類號： S572.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0045-03

收稿日期：2013-11-25

基金項目：臨滄師范高等專科學校高層次人才引進科研啟動項目（編號：LXJ2012）；臨滄師范高等?？茖W校校級課題（編號：LCSZL2013001 ）

。

作者簡介：李曉君（1985—），女，云南臨滄人，博士，講師，主要從事植物生物技術與種質創新研究。E-mail：lxj-148@163.com。植物瞬時表達系統常用于基因產物的亞細胞定位、蛋白間互作、轉錄因子與啟動子之間的互作、啟動子分析等方面的研究[1-2]。植物瞬時表達系統中外源基因的導入方法有植物病毒介導法、PEG法、電擊法、基因槍法和農桿菌滲透法[2]。農桿菌滲透法是一種比較簡便的方法，通過將植物表達載體導入農桿菌，用真空法或注射法將農桿菌導入植物細胞，使得農桿菌Ti質粒上的T-DNA區整合到植物基因組中，T-DNA 區的目標基因培養幾天后即可得到表達[3]。較其他方法而言，農桿菌滲透法具有轉化效率高、基因表達在完整活體內進行、可攜帶較大片段的目的基因等優點[2]。原生質體是觀察基因瞬時表達情況的優選材料，傳統的原生質體轉化方法首先要制備高濃度、高質量的質粒，經過從植物活體材料中分離純化原生質體，在PEG的介導下將質粒DNA導入原生質體，進行原生質體培養后再檢測目標基因的表達情況[4]。用該方法轉化后的原生質體敏感、易破裂，使得陽性細胞檢出率低，不利于觀察。以農桿菌滲透法轉化材料提取原生質體，可縮短從原生質體提取到觀察的時間，原生質體完整，鏡檢陽性率高。本研究在Sparke等的研究基礎[5]上簡化了農桿菌注射液的制備和注射過程，通過熒光顯微鏡觀察注射區域下表皮和原生質體中綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，檢測不同注射濃度下和注射后不同時間的轉化效率，總結出一種高效簡易的農桿菌滲透注射轉化煙草的方法。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1植物材料將普通煙草（Nicotiana tabacum）種子播撒在育苗盤中，2周后移至小花盆，5～6周后即可作為轉化受體。

1.1.2菌種和質粒農桿菌EHA105為臨滄師范高等?？茖W校農學系植物生理實驗室保存，植物表達載體pCAMBIA1304圖譜如圖1（空載體表達GFP-GUS基因，亞細胞定位特點：細胞質[6]）所示。

1.1.3試驗儀器和用具低溫高速離心機（MIKR V22R，HETTICH）、搖床（G-27，EKISO）、熒光顯微鏡（TCS-SP5LEICA）、5 mL 一次性注射器[生工生物工程（上海）

股份有限公司]、低溫冰箱（海爾）。

1.2試劑配制

本試驗所用藥品及試劑均為國產分析純。（1）母液6種。包括0.2 mol/L MES（2-N-嗎啉代乙磺酸）、0.8 mol/L 甘露醇、1 mol/L CaCl2、2 mol/L KCl、1 mol/L乙酰丁香酮、1 mol/L Na3PO4·12H2O。除了甘露醇母液外，其他均4 ℃保存。（2）YEB液體培養基。包括10 g/L酵母膏、5 g/L蛋白胨、5 g/L蔗糖、1 g/L MgSO4。121 ℃滅菌25 min，冷卻，加入3種抗生素（終濃度10 mg/L 卡那霉素、25 mg/L鏈霉素、50 mg/L 利福平），4 ℃保存。（3）注射培養基。包括10 g/L D-果糖、50 mmol/L MES、10 mmol/L CaCl2、2 mmol/L Na3PO4·12H2O、0.1 mmol/L 乙酰丁香酮，現用現配。（4）原生質體提取溶液Ⅰ。包括15 mg/mL 纖維素酶、5 mg/mL 離析酶、20 mmol/L MES、400 mmol/L 甘露醇、20 mmol/L KCl，現用現配。（5）原生質體提取溶液Ⅱ。包括5 mL 1 mol/L CaCl2、5 mL 10% BSA、1 mL β-ME，現配現用，配制后用 0.45 μm 濾頭過濾。（6）W5溶液。包括 2 mmol/L MES、154 mmol/L NaCl、125 mmol/L CaCl2、5mmol/L KCl，可提前配制，4 ℃保存。（7）MMG溶液。包括400 mmol/L 甘露醇、15 mmol/L MgCl2、4 mmol/L MES，可提前配制，4 ℃保存。

1.3農桿菌滲透注射法轉化煙草

1.3.1工程菌的獲得和活化用凍融法將pCAMBIA1304質粒轉入農桿菌EHA105感受態細胞，獲得工程菌株，低溫保存。將10 μL工程菌種接入5 mL的YEB液體培養基（含 10 mg/L 卡那霉素、25 mg/L鏈霉素、50 mg/L 利福平） 中活化12 h（28 ℃，200 r/min）。

1.3.2注射液的準備菌體活化后，按照1 ∶100的體積比進行轉搖（28 ℃，200 r/min），培養5～6 h，離心，收集菌體（室溫、1 000 g、10 min），加入1/2菌液體積的注射培養基進行重懸，室溫下1 000 g離心10 min，棄上清，重復1次，去除殘留的抗生素；將菌體用注射培養基進行重懸，用注射培養基稀釋菌體至7個濃度，其對應的D600 nm為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5，此時配制得菌體注射液，此注射液可室溫放置4～5 h，也可立即使用。

1.3.3注射法轉化注射前將煙草在日光燈下培養2～3 h，以便煙草氣孔張開而有利于注射。選擇煙草植株中部較大的2張葉片進行注射，先用去掉針頭的注射器輕輕擦除無主脈處的下表皮蠟質，形成注射點；用無針頭的注射器吸取0.5～1.0 mL的菌體注射液，左手扶著注射葉片正面，右手將菌體注射液由注射點輕輕地推入，每個點注射量以注射液無法在葉背面擴散為止，每個葉片注射不超過4個點，每個濃度的注射液注射5個植株。注射后，用標記筆標記注射液擴散的范圍。為了防止操作失誤引起的注射液噴射，在注射的過程中要帶口罩、手套和眼鏡。如果同時進行多個工程菌的注射，在注射不同的菌前更換1次手套，防止交叉污染。注射完后，將煙草放置于培養箱中，如果天氣晴朗，也可直接置于大棚內培養，隔天澆1次水。

1.4顯微觀察目標蛋白表達情況

由于pCAMBIA1304表達的為GUS-GFP融合基因，因此可以通過GUS染色和熒光顯微觀察2種途徑進行目的蛋白表達的檢測。本研究通過熒光顯微觀察方法進行GFP蛋白表達的檢測。（1）直接觀察法。注射后第2天開始，每天撕取一小片（1 cm2左右）的注射液擴散范圍的煙草下表皮，放在載玻片上（滴水），蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡進行觀察，連續觀察7 d，檢測陽性細胞的比例。（2）原生質體觀察法。轉化后第4天，收集各個菌液濃度處理的3個植株葉片，每個植株取1.5 cm2左右，混樣提取原生質體。原生質體提取參照RAO等的方法[7]，先根據樣品配制提取溶液Ⅰ（每份樣品5 mL），將提取酶液溶液Ⅰ在55 ℃下溫育10 min，冷卻后加入提取溶液Ⅱ（每份樣品110 μL）；將葉片切成1 mm寬的細條，放入酶液Ⅰ和酶液Ⅱ的混合液中，用鑷子打散；抽真空 20 min 后消化3 h，搖勻，在裂解液中加入W5溶液稀釋（每份樣品5 mL），用300目鋼網過濾雜質和碎片。將濾液吸入 2 mL 離心管中，100 g離心2 min后小心將離心管置于冰上15 min，去上清，加入MMG溶液調整各個樣品的原生質體濃度至基本一致，約100 萬個/mL。用熒光顯微鏡進行檢測各個樣品的陽性細胞比例，統計3個10倍鏡視野下的陽性細胞占正常原生質體的比例，在明場下檢測完整原生質體占視野中總原生質體的比例，以未注射的煙草作為以上2個觀察試驗的空白對照。

2結果與分析

2.1轉化煙草下表皮觀察

轉化后第2天開始，每天撕取不同濃度菌液注射后的煙草植株葉片的下表皮用熒光顯微觀察GFP的表達情況，由表1可見，除了D600 nm 為0.1的注射樣品外，在注射后第3天均可在煙草葉片下表皮中觀察到綠色熒光，而注射濃度D600 nm為0.3～07之間的注射樣品在第4天和第7天均可檢測到較強的綠色熒光。菌液濃度D600 nm>0.9時會降低轉化效率；注射液D600 nm為0.5時，GFP的表達強度在第4天至第6天最好。

2.2菌液注射濃度對轉化效率和原生質體成活率的影響

轉化后第4天，提取不同濃度菌液注射后的煙草葉片原生質體進行觀察，對GFP陽性細胞的比率進行統計，并在明場下統計破損原生質體的比例，結果如圖2所示。當D600 nm為0.1或大于0.9時，陽性細胞的檢出率均低于20%；而在0.3～07 之間時，陽性細胞檢出率均在30%以上；0.5則為最佳轉化濃度，轉化率達45%，原生質體較為完整，轉化效率較高。隨著注射濃度的增加，菌液對葉片細胞的傷害增強，當D600 nm>0.9時，提取的原生質體成活率降低至60%以下。圖3為轉化后第4天注射菌液濃度D600 nm為0.5時注射區域煙草下表皮和原生質體中GFP的表達情況。

3結論

農桿菌介導轉化煙草的瞬時表達常常通過離體滲透法，也可通過注射法進行[8-9]。本研究所用的農桿菌滲透轉化法在轉化過程中只需配制菌體培養液和注射液，注射液現配現用，比較方便快捷。通過熒光顯微鏡在細胞水平對轉化效率進行分析，并分析注射液濃度對原生質體成活率的影響，結果表明注射液的濃度對試驗結果有重要影響，注射液濃度D600 nm 為0.3～0.7時均能得到理想的結果，在第4天至第6天時進行檢測最為合適。在亞細胞定位研究中，利用 X-GFP-GUS 融合蛋白表達系統，其優點是在檢測目標蛋白的表達時，既可以通過GUS染色的方法觀察目的基因在植物不同組織和不同發育時期的表達情況，也可以直接通過顯微觀察細胞中的GFP熒光信號分析目的基因的亞細胞定位和蛋白互作情況；且X-GFP-GUS融合蛋白分子量較大，可以防止融合蛋白自由擴散，對于目的蛋白分子量較小的基因可以減少定位誤差[10]。

參考文獻：

[1]吳玉，楊迎伍，鄧偉，等. 番茄EBF2基因的克隆、亞細胞定位與遺傳轉化[J]. 核農學報，2010，24（3）：490-494.

[2]趙文婷，魏建和，劉曉東，等. 植物瞬時表達技術的主要方法與應用進展[J]. 生物技術通訊，2013，2（2）：294-300.

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[4]McLntosh K B，Hμlm J L，Young L W，et al. A rapid Agrobacterium-mediated Arabidopsis thaliana transient assay system[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2004，22（1）：53-61.

[5]Sparkes I A，Runions J，Kearns A，et al. Rapid，transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants[J]. Nature Protocols，2006，1（4）：2019-2025.

[6]周雪莉，王園，劉菊華，等. 香蕉MuMADS1基因表達產物的亞細胞定位[J]. 生命科學研究，2009，13（5）：418-421.

[7]Rao K S，Prakash A H. A simple method for the isolation of plant protoplasts[J]. Journal of Biosciences，1995，20（5）：645-655.

[8]吳英杰，姜波，張巖，等. 農桿菌介導的煙草瞬時表達試驗條件優化[J]. 東北林業大學學報，2010，38（9）：110-112.

[9]黎茵，張以順. 農桿菌注射滲透法轉化煙草實驗研究[J]. 實驗技術與管理，2010，27（11）：50-52.

[10]Poon I K，Jans D A. Regulation of nuclear transport：central role in development and transformation？[J]. Traffic，2005，6（3）：173-186.林麗飛，李紹梅，劉春國，等. 重金屬鉻、銀對短葶飛蓬愈傷組織誘導的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（9）：48-50.

1.3.3注射法轉化注射前將煙草在日光燈下培養2～3 h，以便煙草氣孔張開而有利于注射。選擇煙草植株中部較大的2張葉片進行注射，先用去掉針頭的注射器輕輕擦除無主脈處的下表皮蠟質，形成注射點；用無針頭的注射器吸取0.5～1.0 mL的菌體注射液，左手扶著注射葉片正面，右手將菌體注射液由注射點輕輕地推入，每個點注射量以注射液無法在葉背面擴散為止，每個葉片注射不超過4個點，每個濃度的注射液注射5個植株。注射后，用標記筆標記注射液擴散的范圍。為了防止操作失誤引起的注射液噴射，在注射的過程中要帶口罩、手套和眼鏡。如果同時進行多個工程菌的注射，在注射不同的菌前更換1次手套，防止交叉污染。注射完后，將煙草放置于培養箱中，如果天氣晴朗，也可直接置于大棚內培養，隔天澆1次水。

1.4顯微觀察目標蛋白表達情況

由于pCAMBIA1304表達的為GUS-GFP融合基因，因此可以通過GUS染色和熒光顯微觀察2種途徑進行目的蛋白表達的檢測。本研究通過熒光顯微觀察方法進行GFP蛋白表達的檢測。（1）直接觀察法。注射后第2天開始，每天撕取一小片（1 cm2左右）的注射液擴散范圍的煙草下表皮，放在載玻片上（滴水），蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡進行觀察，連續觀察7 d，檢測陽性細胞的比例。（2）原生質體觀察法。轉化后第4天，收集各個菌液濃度處理的3個植株葉片，每個植株取1.5 cm2左右，混樣提取原生質體。原生質體提取參照RAO等的方法[7]，先根據樣品配制提取溶液Ⅰ（每份樣品5 mL），將提取酶液溶液Ⅰ在55 ℃下溫育10 min，冷卻后加入提取溶液Ⅱ（每份樣品110 μL）；將葉片切成1 mm寬的細條，放入酶液Ⅰ和酶液Ⅱ的混合液中，用鑷子打散；抽真空 20 min 后消化3 h，搖勻，在裂解液中加入W5溶液稀釋（每份樣品5 mL），用300目鋼網過濾雜質和碎片。將濾液吸入 2 mL 離心管中，100 g離心2 min后小心將離心管置于冰上15 min，去上清，加入MMG溶液調整各個樣品的原生質體濃度至基本一致，約100 萬個/mL。用熒光顯微鏡進行檢測各個樣品的陽性細胞比例，統計3個10倍鏡視野下的陽性細胞占正常原生質體的比例，在明場下檢測完整原生質體占視野中總原生質體的比例，以未注射的煙草作為以上2個觀察試驗的空白對照。

2結果與分析

2.1轉化煙草下表皮觀察

轉化后第2天開始，每天撕取不同濃度菌液注射后的煙草植株葉片的下表皮用熒光顯微觀察GFP的表達情況，由表1可見，除了D600 nm 為0.1的注射樣品外，在注射后第3天均可在煙草葉片下表皮中觀察到綠色熒光，而注射濃度D600 nm為0.3～07之間的注射樣品在第4天和第7天均可檢測到較強的綠色熒光。菌液濃度D600 nm>0.9時會降低轉化效率；注射液D600 nm為0.5時，GFP的表達強度在第4天至第6天最好。

2.2菌液注射濃度對轉化效率和原生質體成活率的影響

轉化后第4天，提取不同濃度菌液注射后的煙草葉片原生質體進行觀察，對GFP陽性細胞的比率進行統計，并在明場下統計破損原生質體的比例，結果如圖2所示。當D600 nm為0.1或大于0.9時，陽性細胞的檢出率均低于20%；而在0.3～07 之間時，陽性細胞檢出率均在30%以上；0.5則為最佳轉化濃度，轉化率達45%，原生質體較為完整，轉化效率較高。隨著注射濃度的增加，菌液對葉片細胞的傷害增強，當D600 nm>0.9時，提取的原生質體成活率降低至60%以下。圖3為轉化后第4天注射菌液濃度D600 nm為0.5時注射區域煙草下表皮和原生質體中GFP的表達情況。

3結論

農桿菌介導轉化煙草的瞬時表達常常通過離體滲透法，也可通過注射法進行[8-9]。本研究所用的農桿菌滲透轉化法在轉化過程中只需配制菌體培養液和注射液，注射液現配現用，比較方便快捷。通過熒光顯微鏡在細胞水平對轉化效率進行分析，并分析注射液濃度對原生質體成活率的影響，結果表明注射液的濃度對試驗結果有重要影響，注射液濃度D600 nm 為0.3～0.7時均能得到理想的結果，在第4天至第6天時進行檢測最為合適。在亞細胞定位研究中，利用 X-GFP-GUS 融合蛋白表達系統，其優點是在檢測目標蛋白的表達時，既可以通過GUS染色的方法觀察目的基因在植物不同組織和不同發育時期的表達情況，也可以直接通過顯微觀察細胞中的GFP熒光信號分析目的基因的亞細胞定位和蛋白互作情況；且X-GFP-GUS融合蛋白分子量較大，可以防止融合蛋白自由擴散，對于目的蛋白分子量較小的基因可以減少定位誤差[10]。

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[6]周雪莉，王園，劉菊華，等. 香蕉MuMADS1基因表達產物的亞細胞定位[J]. 生命科學研究，2009，13（5）：418-421.

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[8]吳英杰，姜波，張巖，等. 農桿菌介導的煙草瞬時表達試驗條件優化[J]. 東北林業大學學報，2010，38（9）：110-112.

[9]黎茵，張以順. 農桿菌注射滲透法轉化煙草實驗研究[J]. 實驗技術與管理，2010，27（11）：50-52.

[10]Poon I K，Jans D A. Regulation of nuclear transport：central role in development and transformation？[J]. Traffic，2005，6（3）：173-186.林麗飛，李紹梅，劉春國，等. 重金屬鉻、銀對短葶飛蓬愈傷組織誘導的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（9）：48-50.

1.3.3注射法轉化注射前將煙草在日光燈下培養2～3 h，以便煙草氣孔張開而有利于注射。選擇煙草植株中部較大的2張葉片進行注射，先用去掉針頭的注射器輕輕擦除無主脈處的下表皮蠟質，形成注射點；用無針頭的注射器吸取0.5～1.0 mL的菌體注射液，左手扶著注射葉片正面，右手將菌體注射液由注射點輕輕地推入，每個點注射量以注射液無法在葉背面擴散為止，每個葉片注射不超過4個點，每個濃度的注射液注射5個植株。注射后，用標記筆標記注射液擴散的范圍。為了防止操作失誤引起的注射液噴射，在注射的過程中要帶口罩、手套和眼鏡。如果同時進行多個工程菌的注射，在注射不同的菌前更換1次手套，防止交叉污染。注射完后，將煙草放置于培養箱中，如果天氣晴朗，也可直接置于大棚內培養，隔天澆1次水。

1.4顯微觀察目標蛋白表達情況

由于pCAMBIA1304表達的為GUS-GFP融合基因，因此可以通過GUS染色和熒光顯微觀察2種途徑進行目的蛋白表達的檢測。本研究通過熒光顯微觀察方法進行GFP蛋白表達的檢測。（1）直接觀察法。注射后第2天開始，每天撕取一小片（1 cm2左右）的注射液擴散范圍的煙草下表皮，放在載玻片上（滴水），蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡進行觀察，連續觀察7 d，檢測陽性細胞的比例。（2）原生質體觀察法。轉化后第4天，收集各個菌液濃度處理的3個植株葉片，每個植株取1.5 cm2左右，混樣提取原生質體。原生質體提取參照RAO等的方法[7]，先根據樣品配制提取溶液Ⅰ（每份樣品5 mL），將提取酶液溶液Ⅰ在55 ℃下溫育10 min，冷卻后加入提取溶液Ⅱ（每份樣品110 μL）；將葉片切成1 mm寬的細條，放入酶液Ⅰ和酶液Ⅱ的混合液中，用鑷子打散；抽真空 20 min 后消化3 h，搖勻，在裂解液中加入W5溶液稀釋（每份樣品5 mL），用300目鋼網過濾雜質和碎片。將濾液吸入 2 mL 離心管中，100 g離心2 min后小心將離心管置于冰上15 min，去上清，加入MMG溶液調整各個樣品的原生質體濃度至基本一致，約100 萬個/mL。用熒光顯微鏡進行檢測各個樣品的陽性細胞比例，統計3個10倍鏡視野下的陽性細胞占正常原生質體的比例，在明場下檢測完整原生質體占視野中總原生質體的比例，以未注射的煙草作為以上2個觀察試驗的空白對照。

2結果與分析

2.1轉化煙草下表皮觀察

轉化后第2天開始，每天撕取不同濃度菌液注射后的煙草植株葉片的下表皮用熒光顯微觀察GFP的表達情況，由表1可見，除了D600 nm 為0.1的注射樣品外，在注射后第3天均可在煙草葉片下表皮中觀察到綠色熒光，而注射濃度D600 nm為0.3～07之間的注射樣品在第4天和第7天均可檢測到較強的綠色熒光。菌液濃度D600 nm>0.9時會降低轉化效率；注射液D600 nm為0.5時，GFP的表達強度在第4天至第6天最好。

2.2菌液注射濃度對轉化效率和原生質體成活率的影響

轉化后第4天，提取不同濃度菌液注射后的煙草葉片原生質體進行觀察，對GFP陽性細胞的比率進行統計，并在明場下統計破損原生質體的比例，結果如圖2所示。當D600 nm為0.1或大于0.9時，陽性細胞的檢出率均低于20%；而在0.3～07 之間時，陽性細胞檢出率均在30%以上；0.5則為最佳轉化濃度，轉化率達45%，原生質體較為完整，轉化效率較高。隨著注射濃度的增加，菌液對葉片細胞的傷害增強，當D600 nm>0.9時，提取的原生質體成活率降低至60%以下。圖3為轉化后第4天注射菌液濃度D600 nm為0.5時注射區域煙草下表皮和原生質體中GFP的表達情況。

3結論

農桿菌介導轉化煙草的瞬時表達常常通過離體滲透法，也可通過注射法進行[8-9]。本研究所用的農桿菌滲透轉化法在轉化過程中只需配制菌體培養液和注射液，注射液現配現用，比較方便快捷。通過熒光顯微鏡在細胞水平對轉化效率進行分析，并分析注射液濃度對原生質體成活率的影響，結果表明注射液的濃度對試驗結果有重要影響，注射液濃度D600 nm 為0.3～0.7時均能得到理想的結果，在第4天至第6天時進行檢測最為合適。在亞細胞定位研究中，利用 X-GFP-GUS 融合蛋白表達系統，其優點是在檢測目標蛋白的表達時，既可以通過GUS染色的方法觀察目的基因在植物不同組織和不同發育時期的表達情況，也可以直接通過顯微觀察細胞中的GFP熒光信號分析目的基因的亞細胞定位和蛋白互作情況；且X-GFP-GUS融合蛋白分子量較大，可以防止融合蛋白自由擴散，對于目的蛋白分子量較小的基因可以減少定位誤差[10]。

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