姜黃素對糖尿病大鼠血腦屏障的影響

（中國醫科大學附屬盛京醫院神經內科，沈陽 110021）

姜黃素對糖尿病大鼠血腦屏障的影響

吳曉黎，王智敏，郝穎，梁鶴繽，鄭東明，郭陽

（中國醫科大學附屬盛京醫院神經內科，沈陽 110021）

目的探討姜黃素對鏈脲佐菌素誘導的糖尿?。―M）大鼠血腦屏障（BBB）的作用。方法實驗動物分為正常對照組、DM組、DM+姜黃素組，3個月后檢測各組大鼠BBB通透性、BBB緊密連接蛋白claudin和occludin的表達，ELISA法檢測大鼠皮層白細胞介素（IL）-10、IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的蛋白含量，Western blot法檢測各組大鼠核因子κB（NF-κB）的表達。結果姜黃素對DM大鼠的血糖沒有顯著影響，但可降低DM大鼠的體質量。DM組大鼠BBB通透性顯著增加（P＜0.01），claudin和occludin的表達顯著降低（P＜0.01），IL-10的表達降低（P＜0.01），IL-6和TNF-α的蛋白含量明顯升高（P＜0.01），NF-κB的表達顯著增加（P＜0.01）。給予姜黃素可升高claudin和occludin的表達（P＜0.05），降低BBB通透性（P＜0.05），減少IL-6和TNF-α的含量（P＜0.05），提高IL-10的含量（P＜0.05），并顯著抑制NF-κB的表達（P＜0.01）。結論應用姜黃素可通過抑制DM誘導的炎性反應，升高claudin和occludin的表達，降低DM大鼠BBB通透性，保護DM大鼠的BBB。其保護作用可能與NF-κB通路有關。

姜黃素；糖尿病；血腦屏障；核因子κB

多年來一直認為糖尿病（diabetes mellitus，DM）與血管病變有關［1］。在腦部，DM導致的血管炎癥使血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）結構和功能的完整性受到破壞［2，3］，這與DM腦血管病并發癥密切相關。DM對BBB的損傷，造成腦內內環境的紊亂，加重神經元的損傷和死亡，增加神經系統事件的風險。但是DM對BBB的具體調節機制尚不明確。

姜黃素是從姜黃屬植物根莖中提取出來的一種酚性色素，具有多方面的藥理作用，在基因和細胞信號通路多水平上具有抗炎等藥理學作用［4］，對動脈硬化、DM等疾病具有良好的防治作用，已經被醫學人員所關注。但其是否對DM的BBB有保護作用尚未見報道。我們應用鏈脲佐菌素介導的DM大鼠模型，觀察姜黃素對BBB結構和功能的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級3月齡雄性SD大鼠，體質量200～220 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。大鼠分為正常對照組、DM組、DM+姜黃素組。DM大鼠模型制備前大鼠禁食12 h，給予單次腹腔注射溶解于pH 4.0～4.2、濃度為0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中的鏈脲佐菌素，劑量為50 mg/kg。正常對照組注入相同劑量生理鹽水。注射后所有大鼠放入代謝籠內常規飼養，自由飲食。大鼠血糖持續超過16.7 mmol/L、尿糖試紙（+++）的大鼠被認定為DM大鼠。4周后根據體質量和血糖匹配的原則，將DM大鼠分為DM組和DM+姜黃素組。姜黃素用1%羧甲基纖維素配成混懸液，DM+姜黃素組每日以姜黃素100 mg/kg灌胃，另2組給以等量的羧甲基纖維素，為期8周。

1.2 主要藥品與試劑

鏈脲佐菌素（美國Sigma-Aldrich公司）；1%羧甲基纖維素、伊文思藍粉劑（evans blue，EB）（美國Fluka公司進口分裝）；兔抗claudin多克隆抗體、小鼠抗ocdudin多克隆抗體（美國Zymed公司）；白細胞介素（interleukin，IL）10、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；小鼠抗大鼠GAPDH抗體、核因子κ B（nuclear factor κB，NF-κB）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；SABC試劑盒、DAB顯色劑、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑（北京中山公司）。

1.3 BBB通透性的測定

各組大鼠在手術前2 h股靜脈注入2%的EB（2 mL/kg）。然后在相應時間點深度麻醉，自左心室灌注生理鹽水300 mL后，斷頭取腦，按1 mL/100 mg腦組織加入甲酰胺溶液，60℃水浴抽提24 h，用分光光度計在620 nm處測光密度值。作出標準曲線，計算腦組織EB含量（μg/g腦質量）。純甲酰胺溶液設為空白對照。

1.4 免疫組化法檢測claudin和occludin表達變化

3個月后大鼠麻醉，開胸，用生理鹽水灌流后4%多聚甲醛灌注固定。取腦置于上述固定液中固定24 h后，再將標本置于30%蔗糖中沉淀24 h。組織塊在恒冷切片機上切片。免疫組化操作步驟按照說明書進行。

1.5 ELISA法檢測腦組織中IL-10、IL-6和TNF-α的蛋白含量

取IL-10、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒，操作步驟按照說明書進行。根據標準品的濃度及對應的光密度值，得到標準曲線及對應的樣品濃度。

1.6 Western blot法檢測腦組織中NF-κB蛋白表達水平的變化

每組各取5只大鼠頸椎脫臼處死、斷頭、剝離并取出大腦皮質，稱取各組標本100 g，剪碎加入冰預冷的細胞裂解液500 μL，超聲粉碎。4℃、12 000 r/min離心0.5 h，取上清。采用酚試劑法測定蛋白濃度。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉印，用含5%去脂奶粉的TTBS封閉4℃1 h。一抗（1∶500），4℃過夜。洗膜，并加入堿性磷酸酶標記的二抗（1∶1 000），室溫下2 h。TTBS清洗2次，每次5 min；TBS洗1次，5 min。酶顯法顯色。使用Chemi lmager 5500 V3.0軟件進行圖像灰度掃描，Fluor Chem 2.0分析軟件進行分析，獲取目的條帶和內參照GADPH的整合光密度值，以兩者的比值作為蛋白表達半定量指標。

1.7 統計學分析

所有數據以x±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和Bonferroni檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量和血糖的比較

DM組大鼠血糖較正常對照組比較顯著升高（P＜0.01），體質量顯著下降（P＜0.01）。DM+姜黃素組血糖較DM組比較無明顯變化（P＞0.05），體質量較DM組明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠的血糖和體質量的比較Tab.1 Comparison of blood glucose and weight between each group

2.2 BBB通透性的變化

采用檢測EB的滲出量評估BBB通透性的變化。與正常對照組相比，DM組EB的含量明顯升高（P＜0.05），DM+姜黃素組EB的含量較DM組顯著下降（P＜0.05）。見表1。

2.3 各組腦組織中claudin和occludin的表達情況

免疫組化法檢測各組腦組織中claudin和occludin的表達變化。如圖1所示，與正常對照組相比，DM組claudin和occludin的表達水平明顯降低（P＜0.01）。與DM組相比，DM+姜黃素組claudin和occludin的表達水平明顯升高（P＜0.05）。見表2。

圖1 各組腦組織中claudin和occludin蛋白的表達Fig.1 Expression of claudin and occludin in brain tissues in each group

表2 各組腦組織中claudin、occludin、IL-10、IL-6、TNF-α和NF-κB含量的變化Tab.2 Changes in expression of claudin，occludin，IL-10，IL-6，TNF-α，and NF-κB in brain tissues in each group

2.4 各組腦組織中IL-10、IL-6和TNF-α的蛋白含量

DM組的IL-10的含量顯著低于正常對照組（P＜0.01）；DM+姜黃素組的IL-10含量明顯低于正常對照組（P＜0.05），明顯高于DM組（P＜0.05）。與IL-10的結果相反，DM組的IL-6和TNF-α含量顯著高于正常對照組（P＜0.01）；DM+姜黃素組的IL-6和TNF-α含量明顯高于正常對照組（P＜0.05），但明顯低于DM組（P＜0.05）。見表2。

2.5 各組NF-κB表達水平的變化

應用Western blot法檢測皮層中NF-κB蛋白表達，見圖2。與正常對照組相比，DM組的NF-κB顯著增加（P＜0.01）；與DM組相比，DM+姜黃素組的NF-κB顯著減少（P＜0.01），見表2。

3 討論

DM破壞BBB的機制非常復雜，目前尚未明確。有人認為DM是一種伴有多種炎性因子激活為特征的自身炎性疾病［5］。中樞神經系統內炎性反應的過度激活可能是DM患者BBB變化的重要機制。姜黃素為姜黃的主要活性成分，近年的大量研究證明姜黃素具較強的抗炎及免疫調節等活性，并且無明顯的毒副作用。本研究旨在探討姜黃素對DM大鼠BBB的改善作用及相關機制。

圖2 各組腦組織中NF-κB的表達Fig.2 Expression of NF-κB in brain tissues in each group

本研究通過建立鏈脲佐菌素誘導的DM大鼠模型并給予姜黃素，觀察姜黃素對DM大鼠血糖、體質量的影響。實驗發現姜黃素對DM大鼠的血糖無明顯影響，但可阻止DM大鼠體質量下降。這與Babu等［6］研究結果相似。

我們通過測定腦組織中EB含量確定各組大鼠BBB通透性的變化。結果顯示，DM組EB含量明顯升高，BBB通透性增加。免疫組化結果顯示，DM組claudin和occludin的表達顯著降低，BBB完整性受到破壞。以上結果提示DM顯著破壞了BBB的完整性，增加了BBB的通透性。本研究中我們發現，給予姜黃素可顯著降低DM組EB的含量，BBB通透性降低，同時顯著增加DM組緊密連接蛋白claudin和occludin的表達，與DM組比較有顯著差異。與此結果相似，Jiang等［7］發現姜黃素可通過保護局灶性腦缺血大鼠的BBB而起神經保護作用。Sun等［8］證實姜黃素可通過降低腦出血小鼠基質金屬蛋白酶，降低BBB通透性，進而改善神經功能。

目前發現與DM相關的炎性因子很多，包括TNF-α［9］、IL-6［10］、IL-1β［11］等。大量研究表明姜黃素具有較強的抗炎作用，Li等［12］發現姜黃素可通過抑制DM大鼠TNF-α從而減輕DM引起的神經性疼痛。本研究結果顯示，DM大鼠腦組織中IL-10的含量顯著降低，IL-6和TNF-α的含量明顯升高。給予姜黃素后，IL-10的含量明顯升高，而IL-6和TNF-α含量顯著降低。以上結果表明姜黃素具有較強的抗炎作用。

NF-κB廣泛地參與炎性反應、免疫反應等多種生物學效應。NF-κB信號通路的失調與很多疾病有關，比如慢性炎癥、DM、自身免疫疾病等。調控NF-κB信號通路是治療炎癥、腫瘤及代謝相關疾病的重要策略。研究發現，NF-κB信號通路與DM微血管內皮損傷密切相關。HO等［13］發現高糖激活NF-κB，并進一步誘導人血管內皮細胞死亡。NF-κB的持續激活可能是DM微血管病變、BBB破壞的始動機制之一。近年來研究表明，姜黃素可抑制刺激后NF-κB的活性，從而對多種疾病發揮治療與預防作用。姜黃素通過抑制NF-κB的活性而產生強大的抗炎作用［14，15］，而且姜黃素還可通過抑制NF-κB抑制蛋白α激酶和蛋白激酶B進而抑制NF-κB的活性［16］。本研究中，Western blot結果顯示，DM大鼠NF-κB的表達顯著增加。而給予姜黃素后，NF-κB的表達顯著降低。說明姜黃素顯著抑制了DM大鼠NF-κB的激活。

綜上所述，姜黃素對DM大鼠的BBB有保護作用。姜黃素可顯著抑制DM大鼠中樞神經系統炎性反應，降低BBB通透性，保護BBB結構和功能的完整性。上述作用與其對NF-κB的抑制作用密切相關。

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（編輯陳姜）

Effectsof Curcumin on Blood-brain Barrier in ExperimentalStreptozotocin-induced Diabetic Rats

WUXiao-li，WANGZhi-min，HAOYing，LIANGHe-bin，ZHENG Dong-ming，GUO Yang
（DepartmentofNeurology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110021，China）

ObjectiveTo study the effect of curcumin on blood-brain barrier（BBB）in streptozotocin-induced diabetes mellitus（DM）rats.MethodsThe rats were divided into 3 groups randomly：the control group，the DM group and the DM+curcumin group.The permeability of BBB and the expressions of tight junction proteins claudin and occludin were detected after 3 months.ELISA analysis was used to detect the expression of interleukin（IL）-10，IL-6 and tumornecrosis factorα（TNF-α）levels.Western blotwas used to determine the expression ofnuclearfactorκB（NF-κB）.ResultsThe weightofDMratswas significantly reduced by curcumin，butblood glucose was notaffected.In the DMgroup，BBB permeability was significantly increased（P＜0.01）；the expression levels of claudin and occludin were significantly decreased（P＜0.01）；the expression levels of IL-6 and TNF-α were significantly up-regulated（P＜0.01）；the expression level of IL-10 was significantly reduced（P＜0.01）；and the expression level of NF-κB was significantly up-regulated（P＜0.01）.Then，administration of curcumin increased the expression of claudin and occludin（P＜0.05），reduced BBB permeability（P＜0.05），decreased the levelofIL-6 and TNF-α（P＜0.05），increased the levelof IL-10（P＜0.05），and significantly inhibited the expression of NF-κB（P＜0.01）.ConclusionCurcumin has protective effects on BBB in DM rats by inhibiting inflammatory reactions induced by DM，increasing the expression of claudin and occludin and reducing BBB permeability in DM rats.The protective mechanism may be associated with the NF-κBchannel.

curcumin；diabetes mellitus；blood-brain barrier；nuclear factor κB

R743.32

A

0258-4646（2015）04-0298-04

國家自然科學基金（81000467）

吳曉黎（1973-），女，講師，博士. E-mail：77kwuxiaoli@163.com

2015-01-07

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