蘇云金芽孢桿菌原生質體的制備及大質粒轉化

韓光杰+孫俊+李傳明+劉琴+徐健

摘要：研究蘇云金芽孢桿菌原生質體制備與再生的最佳條件，為進一步提高原生質體轉化率打下基礎。通過酶解法對蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種工業生產菌株（Bacillusthuringiensisssp.kurstaki）2671原生質體的制備及再生條件進行了研究，考察了菌體生長狀態、溶菌酶濃度、處理時間等影響因素，采用PEG法對大質粒進行原生質轉化。結果表明，對數生長前期的菌體（培養3h），以SMML作滲透壓穩定劑，溶菌酶濃度7mg/mL，40℃下酶解40min，原生質體生成量可達5.7×107個/mL，再生率可達14.1%。在此條件下，采用PEG法可將大質粒pLTV1-ep成功轉化宿主菌，轉化率為0.3CFU/μg。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；原生質體；制備；轉化

中圖分類號：S482.3+9文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0037-03

蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，簡稱Bt）是使用最為廣泛的生物農藥[1]。目前，已經從Bt的不同亞種中分離了超過100種殺蟲晶體蛋白[2-3]，但每個亞種的致病力又極其有限。插入外源基因構建工程菌是提高其殺蟲效果的有效方法之一。Bourgouin等將球形芽孢桿菌的毒素基因成功轉入Bt并表達[4]。Barboza-Corona等將幾丁質酶基因導入Bt中，并分析了工程菌孢子及殺蟲晶體的形成情況[5]。

目前，工程菌的構建主要采用原生質體轉化和電轉化。Yu等通過電轉化將cyt1Aa和cry11Aa導入Bt中產生工程菌TnX，并將Bt菌株S184-Tet與TnX進行原生質融合，形成了新的重組菌TnY[6]。Akamatsu等利用原生質體轉化將質粒pC194、pUB110、pCB1、pAC32R2成功導入枯草芽孢桿菌[7]。然而在構建Bt工程菌時多采用電轉化[8-10]，對原生質體轉化的研究則相對較少，與電轉化相比，原生質體轉化相對溫和，不需轉化設備，獲得陽性轉化子的概率較大，在試驗條件不足、感受態形成受阻或大質粒轉化時，原生質轉化顯得尤其重要。

不同Bt菌株的理化性質、毒素基因的遺傳定位都不盡相同[11]，這就決定了每個菌株的原生質形成條件是不同的。研究表明，菌齡、溶菌酶的濃度、處理時間等對原生質體的形成有很大影響[12]，原生質體的形成率與再生率也影響著原生質轉化效率[13]。本研究通過對蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種原生質體形成的影響因素、再生率及大質粒原生質轉化的分析，建立起一套完整的原生質體轉化方法，為基因工程改良奠定了技術基礎，也為不同菌株原生質轉化提供了一種模式。

1材料與方法

1.1菌株和質粒

蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種（B.thuringiensisssp.kurstaki2671）為實驗室野外分離菌株，具有高效殺蟲活性，已工業化生產。質粒pLTV1-ep為筆者所在實驗室構建含增效蛋白基因的Tn917轉座子載體，其大小為23.3kb。

1.2試劑及培養基

溶菌酶購于碧云天生物公司，PEG6000購于上海生工。2×SMM：0.1mol/L順丁烯二酸，0.5mol/L蔗糖，0.02mol/LMgCl2·6H2O。SMML：由2×SMM和4×LB等體積混合而成。

DM3再生培養基：每100mL含1.6g瓊脂粉，50mL1mol/L琥珀酸鈉（pH值7.3），2g酪蛋白氨基酸水解物，1g酵母膏，0.7gK2HPO4、0.3gKH2PO4、0.234gNaCl、3mL20%葡萄糖、500μL2%牛血清白蛋白。

1.3原生質體的制備和再生

參考Bianca等的方法[12，14]，并進行優化。從新鮮平板上挑一單菌落，接種于5mLLB培養基中，30℃、250r/min培養過夜后以1%接種量轉接到新鮮的25mLLB培養基中，振蕩培養3h。離心收集菌體，用4mLSMML重懸，加200mg/mL溶菌酶至終濃度為7mg/mL，40℃、100r/min培養50min至85%的細胞變為原生質體。將原生質體離心去掉酶液，懸于SMML中，經稀釋后涂布于DM3再生培養基上，培養2～3d，計算原生質體的形成率及再生率。計算方法為：

形成率=（A-B）/A×100%；

再生率=（C-B）/（A-B）×100%。

式中：A、B分別為溶菌酶處理前后在LB培養基上的菌落數；C為溶菌酶處理后在高滲培養基上的菌落數。

1.4原生質體的轉化

根據Chang等的方法進行優化[15]。培養2d后，計算轉化率。

1.5轉化子的檢測

挑取抗性平板的單菌落，接種于紅霉素（15μg/mL）抗性LB培養基中，30℃、250r/min培養過夜后，提取質粒，PCR檢測。

2結果與分析

2.1菌體生長狀態對原生質體形成的影響

細胞的菌體生長狀態是決定蘇云金芽孢桿菌原生質體形成的重要因素。在轉接培養時，分別取對數前、中、后、穩定期的菌體制備原生質體，研究菌體生長狀態對原生質體形成的影響，使用5mg/mL的溶菌酶處理菌體，42℃水浴1h后鏡檢。從圖1中可以發現，對數早期，轉接培養3h的菌體能形成大量的原生質體，培養4h后原生質體形成減少，且有很多桿狀菌體存在。隨著培養時間的延長，原生質體的形成量逐漸降低，對數后期和穩定期基本不形成原生質。

2.2溶菌酶濃度對原生質體形成的影響

收集培養至對數前期3h的菌體，用SMML重懸，分別以1、2、3、4、5、6、7、8、9mg/mL9個不同濃度的溶菌酶在42℃，100r/min下酶解1h，結果見圖2。原生質體形成時酶濃度對其有極大影響。當溶菌酶濃度為1mg/mL時，原生質體的形成率最小，為53.1%；隨著溶菌酶濃度的提高，原生質體形成率越來越大，當溶菌酶濃度為9mg/mL時，原生質體的形成率達到95%，但溶菌酶濃度越高，原生質體形成率就越低。原生質體形成率達到85%以上基本能滿足試驗要求，此時溶菌酶濃度為7mg/mL。

2.3酶解溫度對原生質體形成的影響

溫度對酶解作用有雙重影響，溫度升高，酶解作用加快，溫度降低，酶解時間延長，原生質體被毒害作用增加。分別以32、35、37、40、42℃5個溫度酶解1h進行試驗，結果見圖3。隨著溫度升高，原生質體的形成率變大，42℃酶解1h，原生質體形成率能達到94.4%，但原生質體的形成量很低。在40℃時，原生質體的生成量相對較高，形成率達到87.9%。

2.4酶解時間對原生質體形成的影響

溶菌酶對細菌的質膜會有一定的破壞，因此酶解時間的長短會嚴重影響原生質體的再生。將菌體分別酶解30、40、50、55、60min后稀釋涂布再生培養基，結果見表1。酶解溫度40℃時，隨著酶解時間的增長，原生質體的形成率逐漸增大，原生質體的形成量在酶解50min時達到最大，為7.4×107CFU/mL，但原生質體再生率在酶解40min達到最大值，為14.1%，酶解60min后，原生質體基本上不能再生。

2.5原生質體的轉化與檢測

使用帶有紅霉素抗性的質粒pLTV1-ep轉化B.thuringiensisssp.kurstaki2671，轉化率為0.3CFU/μg。挑取陽性轉化子，經菌落PCR擴增，結果有2.7kb左右大小的目的條帶，與預期大小一致，表明得到的轉化子為陽性（圖4）。

3討論

蘇云金芽孢桿菌作為微生物殺蟲劑，在中國被廣泛應用，基因工程殺蟲菌的研究為提高殺蟲活性和殺蟲譜提供了重要方向。前人在構建工程菌的時候多采用電轉化。電轉化理論上的轉化效率較高，但質粒較大時就很難轉化，且緩沖液配方的選擇是形成感受態的關鍵因素。相關方面前人已有較多研究[9-10，16-18]，制作不同的電擊緩沖液，并摸索了電擊轉化條件等影響因素，質粒pLTV1-ep均不能被轉化。可能由于該質粒大于15kb，電擊轉化相對較難，且該菌株不易形成感受態。原生質體轉化則從理論上來講，所有菌株都應該可以被成功轉化的，除非有限制修飾系統。然而在形成原生質體的時候，會受到各個因素的影響，比如菌體培養時間、溶菌酶濃度、酶解溫度、酶解時間等。本研究從上述因素分析了B.thurtingiensisssp.kurstaki2671菌株原生質體的形成條件、再生率及轉化。

蘇云金芽孢桿菌為革蘭氏陽性細菌，細胞壁較壁中肽聚糖層厚，原生質體較難制備。菌齡過大，細胞壁致密，對酶有抗性，原生質體形成較難；菌齡較小，制備的原生質體大小不均，量小且易破裂不易再生。本研究采用1%接種量培養3h后，獲得穩定性好、形成率高的原生質體。相關文獻報道，在培養時添加甘氨酸，可以直接形成原生質體，本研究按此方法，在轉接時添加4%的甘氨酸培養4h后，形成了原生質體，但原生質體的形成量極低，且菌液黏稠，不適宜用于原生質轉化。

不同的細菌還需要調整原生質體制備液各組分的含量和pH值。相關研究表明，增加馬來酸的含量可以提高原生質體的形成率，本研究在使用含0.02mol/L馬來酸的制備液時，原生質體很難形成，但含量增加到0.1mol/L時，原生質體形成就相當穩定。細胞酶解的pH值也隨著酶和菌種的特性而定。韓璞等在pH值為8.0的溶液中制備了羅伊氏乳桿菌原生質體[19]；Boixet等在pH值7.0的溶液中制備保加利亞乳桿菌的原生質體[20]；莫靜燕等在pH值6.5的溶液中制備了地衣芽孢桿菌的原生質體。本研究選用溶菌酶最適的pH值6.5的條件下制備了原生質體，研究結果表明，只有當菌齡很低的時候，才能形成原生質體，菌齡超過3h后，原生質體形成率就很低，可能由于菌齡增大，細胞壁厚度增加，不利于溶菌酶的作用。在后期的研究中發現，提高pH值至8.0時，原生質的形成不受菌齡的影響，但再生率下降。

本研究對B.thurtingiensisssp.kurstaki2671原生質體的研究主要集中在制備、再生方面，但原生質體最終目的是用于DNA轉化。在質粒轉化的研究中，主要參考Chang等的方法[15]，選用40%PEG6000介導，成功獲得陽性轉化子。在保證原生質體感受狀態的條件下，原生質體的轉化效率還與質粒的構型、選擇標記相關。本研究在電轉化無法進行的情況下，利用原生質體轉化成功獲得陽性轉化子，但轉化效率還很低，原生質體的形成和轉化還有待繼續優化。

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