CALR基因：慢性骨髓增殖性腫瘤(CMPN)新分子標記物

CALR基因：慢性骨髓增殖性腫瘤(CMPN)新分子標記物

[引著格式]周靖，黃知平.CALR基因：慢性骨髓增殖性腫瘤(CMPN)新分子標記物[J].長江大學學報(自科版)，2015，12(30)：83~86.

周靖，黃知平(長江大學荊州臨床醫學院 荊州市中心醫院血液內科，湖北 荊州 434020)

[摘要]慢性骨髓增殖性腫瘤(CMPN)是骨髓中一系或多系髓系細胞增殖的克隆性造血干細胞疾病。近年來，多個分子標志物如JAK2、MPL基因突變等相繼被發現，但仍有30%～45%的攜有野生型JAK2/MPL的原發性血小板增多癥(ET)或原發性骨髓纖維化(PMF)患者缺乏特異性分子標記物，診斷存在困難。近期新發現的鈣網蛋白基因(CALR)突變將能填補這一空白，有望成為診斷骨髓增殖性腫瘤又一種新的分子標記物，對于理解CMPN的分子發病機制具有重要意義，對這類疾病進行診斷和治療具有重要意義。

[關鍵詞]慢性骨髓增殖性腫瘤；鈣網蛋白基因(CALR)突變；分子標記物

骨髓增殖性腫瘤(CMPN)，既往稱作骨髓增殖性疾病(MPD)，由于其具有腫瘤性特征，2008年WHO已用“慢性骨髓增殖性腫瘤(CMPN)”代替“骨髓增殖性疾病(MPD)”[1,2]。真性紅細胞增多癥(PV)、原發性血小板增多癥(ET)和原發性骨髓纖維化(PMF)劃為BCR-ABL融合基因陰性的骨髓增殖性腫瘤(CMPN)[1]。骨髓增殖性腫瘤是以分化相對成熟的一系或多系髓細胞過剩為特征的一類造血干細胞克隆性疾病，臨床表現為易出血、血栓、骨髓纖維化、不同程度的髓外造血和白血病轉化風險[2～4]。與骨髓增生異常綜合征不同，CMPN伴隨正常成熟和有效造血，脾臟腫大為其共同及常見癥狀。

2005年國外多個研究小組證實在97%的PV患者中發現了JAK2 V617F突變[5]，從而開創了分子診斷的“JAK2時代”[4,6]。隨后，Pardanani等在ET及PMF患者中發現了MPL W515I突變，在PV患者中并未發現這一突變位點[7]。在這些分子標志物發現之前，雖然基于血常規、骨髓細胞學、骨髓活檢等設計了一系列CMPN疾病診斷規則，但是在很多情況下，其血液、骨髓象等表現有明顯重疊，難以準確診斷。隨著JAK2 V617F、MPL W515、JAK2 exon12等基因突變的發現，CMPN的診斷有了突破性的進展[8]。研究證實約95%的PV和半數的ET/PMF存在JAK2 V617F突變，5%～10%的CMPN患者攜帶MPL或JAK2 exon12突變[4,7]。2008年WHO已經將JAK2和MPL突變列入診斷PV、ET和PMF的指標之一[9]。但仍有30%～40%的攜有野生型JAK2和MPL的ET或PMF患者中尚未鑒定出特征性的基因異常，因此確診仍有困難。2013年美國血液學會年會(ASH)上，英國劍橋Tefferi[10]和奧地利KLampfl等[11]同時報道在70%～80%的JAK2和MPL突變陰性的ET和PMF患者中存在鈣網蛋白基因(CALR基因)突變，并證實CALR基因突變主要見于CMPN，很少見于MDS患者，為CMPN的特征性突變。聯合檢測JAK2、MPL和CALR基因突變，陽性率可達97%[10,11]。CALR基因的發現填補了JAK2/MPL突變陰性CMPN疾病分子生物學診斷的空白，作為有利的補充，CALR的發現對研究CMPN的分子發病機制、診斷及預后有著非常重要的意義，同時亦為治療帶來了新的靶位。

1CALR基因的功能結構

CALR蛋白位于內質網，是一種鈣通道結合分子伴侶，是進化上高度保守的多功能蛋白，可協助蛋白質折疊并維持細胞內鈣離子穩態，從而在體內發揮多種功能，參與免疫反應調節、細胞增殖調亡、細胞吞噬和纖維化過程[10]。CALR基因定位于染色體19p13.2，由3個蛋白結構域：N-結構域(殘基1～180)、P-結構域(殘基181～290)、C-結構域(殘基291～400)和9個外顯子組成。CALR基因突變是由于第9號外顯子插入或缺失，從而導致一個堿基對的讀碼框移位，繼而產生一種缺乏內質網保留序列(即KDEL氨基酸序列：Lys-Asp-Glu-Leu)的新型C-羧基末端的蛋白，CALR突變類型多樣，其突變后C端氨基酸結構改變可能引起蛋白功能改變[10～12]。為了證實CALR基因突變確實導致了蛋白的改變，曾有研究運用免疫印記的方法證實了在人類HEK293T細胞CALR基因代表性結構中發現了CALR蛋白的異常表達。截至目前，已證實存在55種CALR基因突變體，其中最常見的兩種變異體為：由52個堿基缺失引起的1型變異體(p.L367fs*46)和由5個堿基TTGTC插入引起的2型變異體(p.K385fs*47)，約占所有突變類型的80%，缺失型(53%)多于插入型(32%)，缺失型中以del367fs46(37%)和del385fs47(71.4%)為主[10,11]。Vannucchi[13]等利用免疫組化技術檢測攜有CALR基因突變的骨髓活標本，發現免疫染色主要定位于巨核細胞上，說明巨核細胞在CALR陽性的CMPN疾病發病機制中發揮了重要作用。此外在一項體外研究中發現CALR的過度表達可以促進STAT5磷酸化作用并引起信號通道激活，這種激活作用可以被JAK抑制劑阻滯，說明了CALR與JAK2突變可能存在某種類似的機制[10,11]。但是由于目前對CALR基因突變的研究尚未深入，CALR基因如何激活JAK-STAT信號通路及其在CMPN疾病中的發病機制仍不清楚，有待進一步研究[14～16]。

2CALR基因突變的最新研究進展

2013年12月KLampfl等[11]和Tefferi等[10]兩個研究團隊同時報道了在JAK2/MPL陰性的ET和PMF中發現了鈣網蛋白基因(CALR基因)突變，并證實CALR基因突變不發生于PV，僅見于JAK2/MPL陰性的ET和PMF。Klampfl等[11]采用全外顯子測序的方法檢測了1107例CMPN患者，JAK2/MPL陰性的ET和PMF的CALR基因檢出率分別為67%和88%，并擴大研究了460例其他類型的血液腫瘤患者，包括254例AML、45例CML、73例MDS、64CMML、24例RARS-T，僅在RARS-T患者中檢測到3例發生了CALR突變。Tefferi等采用同樣方法檢測了1356例樣本，其中包括896例CMPN(382例PV、311例ET、203例PMF)和460例其他類型的血液腫瘤，同樣證實CALR突變未見于PV，在CMPN陰性的ET/PMF中突變率為70%～84%，僅在MM患者中檢測到8%的突變率，其余標本均未檢測到CALR突變。此外，一項針對于258例PV、Post-PV MF和253例JAK2/MPL(+)的ET、PMF、Post-PV MF的研究[11]中均未發現CALR基因突變。近期，日本[17]和中國[18]的兩個研究小組先后報道了在3例ET患者同時發生了CALR和JAK2基因的突變，CALR和JAK2的同時存在可能說明二者之間存在某種聯系，比如患者本身的遺傳傾向或一個基因突變后引起基因組不穩定從而導致另一突變的發生。但目前這種報道僅為個案，缺乏大宗病例，其發生機制有待研究。

2014年國外最新文獻也對CALR突變最新研究進展進行了報道，Tefferi等[19]檢測了1107例CMPN患者，PV中未檢測到CALR突變，ET和PMF突變率分別為25%、35%；Rumi等[20]檢測了1235例ET/PV患者，PV中未檢測到CALR突變，ET突變率為13.6%；Rotunno等[21]檢測了576例MPN患者，CALR突變檢出率為15.5%。國外大宗病例報道CALR突變率基本一致，但目前為止亞洲地區仍尚缺大宗病例報道。Shirane等[17]檢測了日本133名CMPN患者，ET和PMF的CALR基因檢出率分別為19.6%和30.4%，與國外報道一致。付榮鳳等[18]首次對中國的436例ET患者的研究發現，CALR基因突變率為22.7%。

3CALR基因突變的臨床意義

研究表明，在JAK2/MPL陰性的ET和PMF患者中，CALR突變與其臨床表現及預后有重要意義[13]。存在CALR突變的ET及PMF患者與JAK2/MPL陽性的患者相比較具有如下的臨床表現特點：男性略多見、中位發病年齡較低、高血小板計數、低白細胞計數、低血紅蛋白水平、低LDH水平、低DIPSS-PLUS風險積分、血栓事件發生率較低、心血管事件發生率較低、較少轉化為骨纖及白血病、低輸血依賴和擁有較高的生存率及預后。有文獻報道，發生JAK2和CALR突變的心血管事件累計發生率分別為30.1%和13.5%，10年血栓累計發生率分別為14.5%和5.1%。并且國內外研究[17,18]指出，在ET患者中發生CALR基因2型突變的較之1型的血栓發生概率更低，在PMF患者中，發生1型突變的預后比2型預后好。發生CALR基因突變的PMF患者輸血依賴為13%，與JAK2突變37%相比較明顯偏低。此外，與JAK2突變的PMF患者相比較，發生CALR基因突變的PMF患者其剪接體突變發生率明顯較低(8% vs 42%)[10～13]。為了論證CMPN其他相關基因突變與CALR突變的關系，Tefferi[26]等在254例CMPN標本中篩查了一些相關基因包括：EZH2、ASXL1、IDH、SF3B1、SRSF2和U2AF1等，并未發現它們與CALR突變存在任何顯著的分子或遺傳學關系。此項研究同時發現，JAK2/MPL/CALR三者均陰的CMPN患者預后較差，此外PMF患者預后還受ASXL1的影響，“CALR-ASXL1+”類型預后欠佳[12,15,17]。

4CALR基因突變的檢測

CALR是CMPN中第2個最易發生突變的基因，因此有學者建議將其列為常規檢測指標。CALR基因突變較為復雜多樣，目前已證實有55種突變類型[17,18]，少見的突變類型增加了檢測難度，CALR基因突變率可能被低估，因此對其檢測要求高靈敏性及特異性。目前學者們較多采用基因測序方法進行檢測，但測序方法價格昂貴，過程復雜，耗時較長，不利于臨床快速診斷。基于CALR基因的臨床重要意義，迫切需要更簡單、快速、廉價的檢測技術及方法。Vannucchi等[13]針對CALR突變體研制了一種多克隆抗體，將其用來免疫染色骨髓活檢標本，此種方法快速簡單，能有效區分發生CALR突變的ET和PMF患者，因此免疫組化可作為一個診斷工具。Chi Jianxiang等[23]研制出了一套PCR-HRM體系用于檢測CALR突變，該體系完成檢測僅需3h，操作簡單易行，目前PCR技術已經較為成熟，臨床實驗室普及率高，此項體系可大大提高臨床檢測及診斷效率。

5CALR基因突變與CMPN診斷

CALR基因作為CMPN疾病較為特異的分子指標，作為對野生型JAK2/MPL的ET和PMF診斷的有力補充，對CMPN疾病診斷具有重要的意義[10,11,24]。目前已有較多學者建議將CALR基因檢測納入WHO診斷標準[12,15]。在CMPN臨床診斷中，為避免不必要的檢查和漏洞，可遵循以下診斷流程：①PV患者無需篩查CALR基因；②CALR與JAK2/MPL突變互為排斥，JAK2/MPL為陽性，無需篩查CALR基因；③對ET/MPL疑似患者，首先篩查JAK2基因突變，若為陰性，再行CALR基因突變篩查，若CALR基因突變仍為陰性，再篩查MPL突變；④仍有10% CMPN患者缺乏特殊分子標記，因此骨髓活檢必不可少；⑤應將“CALR-ASXL1+”及“JAK2/MPL/CALR均陰”視為預后高危因素。

6展望

CALR突變的發現對進一步解釋JAK2/MPL陰性的CMPN發病機制有著里程碑式的意義，因此我們有理由相信，CALR和JAK2/MPL一樣將被WHO修訂為CMPN的診斷指標，更期待這些基因突變作為靶向治療的靶點，開啟CMPN分子靶向治療的新時代。

[參考文獻]

[1]Swredlow S H, Campo E, Harris N L, et al.WHO classification of tumours of hematopoietic and lymphoid tissues[J].Lyon, France:Intenational Agency for Research on Cancer,2008,97:3～471.

[2] Campbell P J, Green A R.The myeloproliferative disorder[J].N Eng J Med,2006,355:2452～2466.

[3]Levine R L, Gilliland D G.Myeloproliferative disorders[J].Blood,2008,112:2190～2198.

[4]James C, Ugo V, Le Couedic J P,et al.A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera[J].Nature,2005,434(737):1144～1148.

[5]Tefferi A, Skoda R, Vardiman J W.Myeloproliferative neoplasms: contemporary diagnosis using histology and genetics[J].Nat Rev Clin Oncol,2009,6(11):627～637.

[6]Scott L M, Tong W, Levine R L, et al.JAK2 exon12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis[J].N Eng J Med,2007,356:459～468.

[7]Pikman Y, Lee B H, Mercher T, et al.MPLW515 is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia[J].PLoS Med,2006,3:e270.

[8]康志華，李佩蕾，關明.骨髓增殖性腫瘤的分子標志研究進展[J].中華檢驗醫學雜志，2011,34(1):5～9.

[9]Tefferi A, Vardiman J W.Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 WHO Health Organization criteria and point of care diagnostic algorithnlg[J].Leukemia,2008,22:14～22.

[10]Tefferi A, Pardanani A.CALR mutations and a new diagostic algorithm for MPN[J].Clin Oncol,2014,11:125～126.

[11]Klampfl T,Gisslinger H, Harutyunyan A S, et al.Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms[J].N Eng J Med,2013,369(25):2391～2405.

[12]張群峰,劉維薇,關明.骨髓增殖性腫瘤的新分子標志物:鈣網蛋白基因突變[J].中華檢驗醫學雜志，2014，37(5)：649～652.

[13]Vannucchi V M, Rotunno G, Bartalucci N, et al.Calreticulin mutation-specific immunostaining in myeloproliferative neoplasms: pathogenetic insight and diagnosstic value[J].Leukemia,2014,28: 1811～1818.

[14]肖志堅.骨髓增殖性腫瘤和骨髓增生異常綜合征/骨髓增殖性腫瘤:開啟分子診斷新時代[J].中華血液學雜志，2014，35(3)：385～386.

[15]Tefferi A, Thiele J, Vannucchi A M, et al.An overview on CALR and CSF3R mutations and a proposal for revision of WHO diagnostic criteria for myeloproliferative neoplasms[J].Leukemia,2014，28(7): 1407～1413.

[16]Guglielmelli P, Nangalia J, Vannucchi M, et al.CALR mutions in myeloproliferative neoplasms: hidden behind the reticulum[J].American Journal of Hematology,2014, 89:453～456.

[17]Shirane S, Araki M, Morishita S, et al.JAK2,CALR, and MPL mutation spectrum in Japanese myeloproliferative neoplasms patients[J].Haematologica， Epub ahead of print,2014,78:11～19.

[18]付榮鳳.原發性血小板增多癥患者的臨床及分子生物學特點研究[D].北京：北京協和醫學院，2014.

[19]Tefferi A, Lasho T L, Finke C M, et al.CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-negative myelofibrosis: clinical，cytogenetic and molecular comparisons[J].Leukemia,2014, 28(7): 1472～1477.

[20]Rumi E, Pietra D, Ferretti V, et al.JAK2 or CALR mutation status defines subtypes of essential thrombocythemia with substantially different clinical course and outcomes[J].Blood,2014,123:1472～1551.

[21]Rotunno G, Mannarelli C, Guglielmelli P, et al.Impact of Calreticulin mutations on clinical and hematologyical phenotype and outcome in Essential Thrombocythemia[J].Blood, 2014, 123:1552～1555.

[22]Tefferi A, Guglielmelli P, Lasho T L, et al.CALR and ASXL1 mutation-based molecular prognostication in primary myelofibrosis:an international study of 570 patients[J].Leukemia, 2014,28(7):1494～1500.

[23]Chi Jianxiang, Menelaos Manoloukos, Chryso Pierides,et al.Calreticulin mutations in myeloproliferative neoplasms and new methodology for their detection and monitoring[J].Ann of Hematology,2015,94(3)：399～408.

[24]張丹鳳，潘峻.原發性骨髓纖維化診療進展：第19屆歐洲血液學會年會報道[J].白血病·淋巴瘤，2014:525～529.

[編輯]一凡

[中圖分類號]R551.3

[文獻標志碼]A

[文章編號]1673-1409(2015)30-0083-04

通信作者：

[作者簡介]周靖(1990-)，女，碩士生，主要從事血液腫瘤方向的研究工作；黃知平，15090727839@163.com。

[基金項目]湖北省科技廳科技計劃項目(2009AA301C52)。

[收稿日期]2015-05-28