農桿菌浸種對甘藍種子萌發及幼苗生長的影響

李光遠　王鳳華　蔣燕

摘要：采用不同D600 nm值的農桿菌菌液浸泡甘藍種子，研究農桿菌浸種對甘藍種子萌發及幼苗生長發育的影響，并檢測其轉化效果。結果發現，農桿菌浸種對甘藍種子的發芽率、發芽指數、活力指數均有抑制作用，且D600 nm值越高，抑制作用越明顯。此外，農桿菌浸種對甘藍幼苗的株高、葉面積、根莖比、鮮質量均有顯著抑制作用。葉綠素含量隨D600 nm值增大，呈先增加后降低的趨勢，D600 nm為0.8時，葉綠素含量最高，為7.86 mg/g，D600 nm 為1.6時，葉綠素含量最低，為5.64 mg/g。農桿菌浸種不影響SOD活性，但POD、CAT活性均隨著D600 nm值的升高而升高。農桿菌浸種能獲得一定的PPT抗性苗，其中D600 nm 為0.8時獲得的抗性苗最多，達到10.32%。PCR結果顯示農桿菌浸種能實現基因的轉化，其中D600 nm 為1.6時轉化率最高，達到2.33%。

關鍵詞：甘藍；農桿菌浸種；種子萌發；幼苗；轉化

中圖分類號： S635.04 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0139-03

農桿菌介導的遺傳轉化是目前較廣泛應用的轉基因方法，但是常規的農桿菌介導法依賴于組織培養[1-2]，導致其應用受到一定的限制。農桿菌浸種法是近年誕生的一種轉基因方法，是將萌發的種子直接浸在農桿菌菌液中，利用農桿菌的浸染特性和植物細胞自身的物質轉運系統把外源基因導入受體細胞并整合到基因組中穩定表達，從而實現遺傳轉化[3]，如Feldmann等首次利用農桿菌浸種法將npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因導入了擬南芥[4]，該方法后來相繼在水稻、小麥、黃瓜、番茄、中華結縷草等植物遺傳轉化中取得了成功[5-8]。甘藍的遺傳轉化研究起步早，目前已相繼導入抗蟲基因Bt、蛋白酶抑制劑基因、育性基因、抗病基因、生長素基因等[9]。縱觀甘藍的遺傳轉化，最常采用的方法還是依賴于組織培養的農桿菌介導的遺傳轉化，筆者所在實驗室采用該傳統的轉化方法獲得了部分激活標簽突變體[10]，但是轉化效率低下，且需要在無菌條件下進行離體操作。因此，本研究將采用農桿菌浸種法，將含激活標簽pSKI015的農桿菌轉化甘藍，調查浸種對甘藍種子萌發及幼苗生長的影響，并探討其轉化效果，以期獲得一種甘藍激活標簽突變體材料的簡便轉基因方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試甘藍為夏光種子，供試農桿菌為GV3101（含質粒pSKI015）。

1.2 農桿菌的培養

用LB培養基接種農桿菌，28 ℃、220 r/min振蕩培養過夜，分光光度計測定600 nm下的D值。

1.3 農桿菌浸種

取成熟飽滿發芽率85%以上的種子，用0.4% KMnO4浸種6 min，無菌水沖洗3～4次，25 ℃催芽。待種子80%露白時，再用無菌水沖洗干凈，加入農桿菌液，農桿菌菌液D600 nm分別為0（未加入農桿菌的LB溶液，對照）、0.4、0.8、1.2、1.6。浸種2 h，倒掉菌液，25 ℃黑暗條件下培養2 d后轉入鋪有濾紙的培養皿（濾紙使用1 mg/L的PPT浸濕，適時補加），置于 20 ℃、14 h/d光照的培養箱中培養，觀察記載發芽情況。

1.4 幼苗移栽

種子發芽后統計發芽率、發芽勢、活力指數。用自來水將幼苗沖洗干凈，移栽于穴盤培養。

1.6 生理指標測定

取移栽30 d的苗，測定各生理指標[11]。采用丙酮提取法測定葉綠素含量，氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性，愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性。

1.7 PPT抗性苗篩選

浸種后的種子播種在含1 mg/L PPT的培養皿中發芽，移栽穴盤后后噴施10 mg/L Basta溶液。

1.8 PCR檢測

CTAB提取PPT抗性苗葉片基因組DNA，以BarF （5′-TCGACTCTAGCGAATTC）和BarR（5′-ATAGGCGTCTCGCATATCTC）為引物擴增長度為700 bp的bar基因，未轉化的甘藍為陰性對照，pSKI015為陽性對照，擴增方法和程序參照王愛榮等的方法[12]。PCR 反應總體積 25μL。擴增程序：5 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 35 s，30 個循環；72 ℃延伸 5 min。取擴增產物10 μL于1% 瓊脂糖凝膠上電泳。

1.9 數據處理

用SPSS系統軟件進行數據處理，Microsoft Excel軟件作圖，P<0.05作為顯著性檢測標準。

2 結果與分析

2.1 農桿菌浸種對甘藍種子萌發的影響

由表1可知，隨著農桿菌D600 nm的升高，甘藍種子發芽率基本呈現下降趨勢，其中D600 nm 為0.4時，與對照差異不顯著，但是D600 nm為0.8、1.2、1.6時的發芽率顯著低于對照，D600 nm為1.6時，發芽率最低，D600 nm為0.8 和D600 nm為1.2處理之間差異不顯著。發芽指數的變化與發芽率的變化類似，隨著D600 nm的升高而降低，除D600 nm為 0.4與對照差異不顯著外，其他各處理的種子發芽指數均顯著低于對照。種子活力指數的變化也是隨著D600 nm的升高而降低。除D600 nm為 0.4與對照差異不顯著外，其他各處理的種子活力指數均顯著低于對照。不同的D600 nm之間也存在差異，其中D600 nm 為1.6處理下，種子的活力指數最低，僅為53.6%。由此可知，農桿菌的D600 nm過高，對甘藍種子的萌發有抑制作用。

2.2 農桿菌浸種對甘藍幼苗生長的影響

由表2可知，對照組的根莖比最大，且隨著D600 nm值的增加，根莖比逐漸減小，所有處理的根莖比均顯著低于對照，D600 nm為 0.4、0.8、1.2 3者之間差異不大，D600 nm為1.6處理時的根莖比最低，僅為0.70，比對照降低了約18%。因此，農桿菌浸種對甘藍幼苗的根莖比有抑制作用。甘藍幼苗的葉面積也隨著D600 nm值的增加而降低，其中D600 nm為 0.4與對照差異并不顯著，對照組的葉面積最大，D600 nm為 1.6的葉面積最小。由此可知，農桿菌浸種對甘藍幼苗葉面積有抑制作用，在D600 nm高于0.8時開始表現較明顯的抑制效應。株高的變化與根莖比和葉面積的變化有所不同，僅在D600 nm為1.2、1.6下表現抑制效應。在D600 nm達到1.6時，株高僅為對照的72%。所有單株鮮質量中，對照組最大，與各處理之間差異顯著。D600 nm值為1.6時單株鮮質量最低，僅為對照的56%，D600 nm 為0.4、0.8、1.2 3組之間差異不顯著。由此可見，農桿菌浸種對甘藍幼苗生長存在一定的抑制作用。

2.3 農桿菌浸種對甘藍生理指標的影響

由表3可以看出，在農桿菌D600 nm低于0.8時，隨D600 nm的增大，葉綠素含量增加，D600 nm為0.8時，葉綠素含量達到最大值，之后隨著D600 nm的進一步增大，葉綠素含量開始下降，且明顯低于對照，在D600 nm 達到1.6時，葉綠素含量最低。由此可知，高濃度農桿菌菌液浸種會降低甘藍的葉綠素含量。

表3還顯示，各處理之間SOD活性差異并不顯著，說明農桿菌浸種并不影響SOD活性。POD活性均隨著D600 nm值的增大而升高，對照組的POD活性最低，當D600 nm值大于0.8時POD活性顯著提高，說明農桿菌已經對甘藍造成脅迫，POD活性提高，其清除自由基的能力也提高，從而避免植株受到傷害。CAT活性的變化也是隨著農桿菌菌液濃度升高而增加，當D600 nm大于0.4時，其與對照的差異已經達到顯著水平。由此可見，農桿菌菌液浸種對甘藍是一種脅迫，為了提高其適應逆境的能力，POD活性升高以清除產生的自由基。

2.4 農桿菌浸種對PPT抗性苗率及轉化率的影響

由表4可以看出，采用農桿菌浸種甘藍能獲得一定的PPT抗性苗，其中D600 nm 為0.8時獲得的抗性苗最多，PPT抗性苗率可以達到10.32%，D600 nm 為1.6時獲得的抗性苗最少，僅為8.34%。

提取PPT抗性植株葉片的基因組 DNA，進行PCR 擴增，部分植株擴增到了長約為 700 bp的片段（圖1-B、C、D、G、H），與從質粒Pski015擴增出的片段基本相同（圖1-J），說明基因已經整合到了轉化植株中，但也有例外，如圖1-E擴增出的片段明顯比對照大，具體原因有待進一步研究。

經PCR檢測，統計轉化率結果如表4。由表4可以看出，轉化率的大小依次為D600 nm 0.4

3 討論

植物在逆境條件下通常會表現出衰老癥狀，如葉綠素含量降低，蛋白質、核酸等大分子水解加速，原生質膜以及內膜系統發生過氧化，膜脂過氧化產物MDA含量增加，POD酶促防御系統活性下降等[13]。本研究結果表明甘藍幼苗葉片中的葉綠素含量隨菌液D600 nm值的增加成先升高后降低的趨勢，在 D600 nm為0.8時，葉綠素含量達到最大值，之后開始下降，這與徐開杰等的研究結果[14]有所不同，他們發現隨著農桿菌菌液濃度升高，小麥幼苗葉片中葉綠素含量呈下降趨勢。徐開杰等的結果顯示小麥POD活性隨農桿菌菌液濃度升高呈先升后降的趨勢[14]，而本研究證實甘藍的POD隨著D600 nm的增加一直成上升趨勢。本研究結果還表明隨著農桿菌菌液濃度升高，甘藍種子發芽率、發芽勢、幼苗株高、鮮質量含量呈下降趨勢，這與徐開杰等的結果[14]一致。因此，農桿菌浸種對甘藍是一種脅迫作用，特別是高濃度的農桿菌會影響萌發和幼苗的生長代謝。

轉化率是衡量轉化效果的重要指標，本研究結果表明在低D600 nm值時（D600 nm<0.8），轉化率為零，這與陳明利等的結果[15]類似，他們認為農桿菌濃度D600 nm值小于0.5時，即使采用長時間侵染，轉化效率也不高。但是農桿菌菌液濃度也不宜過高，如本研究中在D600 nm為1.6時，獲得的轉化率雖然較高，但是在此處理下甘藍幼苗生長嚴重受抑、甚至死亡。陳明利等發現，當農桿菌菌液D600 nm超過1.5時，對小麥種子萌發和幼苗生長發育產生了較為嚴重的傷害作用，小麥種子發芽率顯著降低，幼苗出現生長減慢、停止甚至出現白化、最終死亡的現象[15]。他們認為從獲得轉基因植株的規模方面考慮，農桿菌菌液D600 nm不超過1.5，這與本研究結果是一致的。

目前，依賴于組織培養的農桿菌介導的遺傳轉化仍然是甘藍轉基因研究的主要手段。但是這種方法操作繁瑣，需要高頻率的再生系統，特別是組織培養要求無菌，而農桿菌本身又是一種細菌，這增加了無菌操作的難度。因此，探索一種簡單、快捷、高效的遺傳轉化方法勢在必行。種子浸泡法是最近誕生的一種用于植物轉化的方法，已經取得了一定的成功。本研究證實采用農桿菌浸種甘藍也可以實現基因的轉移，雖然轉化率僅為2.33%，但今后深入研究將有助于獲得轉化率更高的轉基因轉化體系。

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