糖絡通對糖尿病周圍神經病變大鼠坐骨神經細胞凋亡及抗氧化酶表達的影響

關鍵詞〔〕糖尿病周圍神經病變；凋亡；氧化應激；抗氧化酶

1河北醫科大學中西結合學院

第一作者：常庚(1981-)，男，醫學博士，主治醫師，主要從事中西醫結合對神經系統疾病的研究。

氧化應激是糖尿病周圍神經病變(DPN)發病機制中的關鍵因素，抑制氧化損傷成為目前治療DPN的關鍵環節。本研究依據中醫“久病入絡”的理論，用自擬方糖絡通觀察其對大鼠DPN的療效，通過檢測坐骨神經細胞凋亡數目、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、血清8-羥基脫氧鳥苷(8-OhdG)的含量以及抗氧化蛋白谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的表達，探討糖絡通減輕神經細胞氧化損傷的機制。

1材料與方法

1.1實驗動物健康清潔級Wistar雄性大鼠90只，體重150～180 g，鼠齡4～6 w，由河北省醫學實驗動物中心提供。

1.2藥品及試劑糖絡通組成：黃芪、紅花、懷牛膝、赤芍、生地、威靈仙、當歸、蜈蚣、桂枝等(購自樂仁堂藥房，經河北醫科大學中藥系鑒定，符合國家藥典標準)，在我校中藥系指導下常規水煎，濃縮至含生藥3 g/ml，備用。測定LDH、MDA、SOD、GSH-Px含量的試劑來自南京建成生物工程研究所；鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自羅氏公司。

1.3模型建立及分組按文獻〔1〕方法復制模型。造模組大鼠禁食12 h后，鏈脲佐菌素(STZ)(溶于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中，pp.3)50 mg/kg一次性腹腔注射，72 h后通過尾靜脈測定血糖，>16.67 mmo/L者為造模成功。造模過程中除2只未成模外，其余全部成模。將造模成功的大鼠再隨機分為模型組及中藥干預組。正常對照組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液。

1.4實驗動物給藥中藥干預組：每日給糖絡通中藥25 g/kg(相當于成人劑量的20倍)。正常對照組、模型組：每日給相同容量的生理鹽水灌胃。中藥干預共8 w。

1.5標本采集中藥干預8 w后禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛完全麻醉后，心腔取血，4℃ 3 500 r/min離心15 min，分離血清及血漿，置于-20℃密封保存備用。剖取坐骨神經，取部分組織固定于4%的甲醛溶液中，常規固定、脫水，石蠟包埋，切片以供檢測細胞凋亡等備用。其余坐骨神經組織制成勻漿，以供檢測LDH 活性、MDA含量。

1.6TUNEL法測定細胞凋亡率應用TUNEL法檢測坐骨神經細胞凋亡，操作步驟按說明書。

1.7坐骨神經組織生化測定采用比色法測定組織勻漿中的LDH 活性、硫代巴比妥酸法測定MDA含量，二硫代二硝苯甲酸法則定GSH-Px含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量，測試操作過程嚴格按照說明書進行。

1.8血清8-OhdG的含量檢測應用ELISA法測定血清8-OhdG的含量，操作步驟按說明書。

1.9統計學方法采用SPSS11.0軟件進行方差分析。

2結果

2.1坐骨神經細胞凋亡數目及坐骨神經組織中LDH含量與正常對照組比較，模型組在坐骨神經細胞凋亡數目、LDH含量顯著增加〔(428.25±21.53)vs (176.37±14.15)U/mg,P<0.01〕；與模型組比較，中藥干預組在坐骨神經細胞凋亡數目和LDH含量顯著下降〔(216.74±17.86)U/mg,P<0.01〕。見圖1。

圖1　TUNEL法檢測坐骨神經細胞凋亡率(×200)

2.2坐骨神經組織中MDA、GSH-Px和SOD的含量與正常對照組比較，模型組大鼠坐骨神經組織中MDA含量顯著增加而GSH-Px和SOD含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，中藥干預組坐骨神經組織中MDA含量均顯著下降而GSH-Px和SOD的含量明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1　中藥干預對8-OhdG、MDA、GSH-Px及SOD的

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

2.3血清8-OhdG的含量與正常對照組比較，模型組大鼠血清8-OhdG含量顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，中藥干預組血清8-OhdG的含量明顯降低(P<0.01)。見表1。

3討論

DPN是糖尿病常見的并發癥之一，起病隱匿，發病率高，是糖尿病患者致殘的主要原因，嚴重影響糖尿病患者的生存質量。因此，如何預防和治療 DPN 是目前研究熱點之一。

高糖狀態誘導的坐骨神經細胞凋亡損傷是導致患者出現神經功能缺損的主要原因〔2〕。臨床病理證實，DPN患者坐骨神經細胞出現典型的凋亡相關的超微結構變化，核膜破裂，染色質凝集，核碎裂分散于胞質中，形成凋亡小體；神經凋亡數目顯著增加。本研究表明，在模型組中大鼠坐骨神經細胞的凋亡數目及LDH含量顯著上升，給予中藥糖絡通干預后，坐骨神經細胞凋亡數目及LDH含量明顯下降，表明糖絡通能有效抑制DPN坐骨神經細胞凋亡，具有顯著的神經細胞保護作用。

脂質過氧化產物的穩定代謝物MDA的含量可反映組織自由基的含量和脂質過氧化程度；8-OhdG是由ROS中羥自由基進攻脫氧鳥苷8位碳原子而形成的。MDA與8-OhdG被認為是DNA氧化損傷標志物，是評價機體氧化應激狀態的敏感指標。臨床與基礎研究證實，體內的在高血糖條件下，活性氧簇生成增多，過量的自由基通過攻擊膜蛋白質、核酸及生物膜上的不飽和脂肪酸，使之發生脂質過氧化反應，致使細胞結構和功能遭到破壞，誘導神經細胞凋亡壞死〔3，4〕。本研究提示在DPN發病過程中，氧化應激是導致神經細胞損傷凋亡的主要發病機制。SOD是生物體內至關重要的氧自由基清除劑；GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，體內SOD與GSH-Px的高低可反映機體清除自由基的能力，也是機體重要的抗氧化防御機制。本研究證實，糖絡通可以有效上調SOD及GSH-Px的表達，減輕坐骨神經細胞的凋亡和損傷。

本實驗推測糖絡通治療DPN變是通過上調GSH-Px和SOD的表達，減輕坐骨神經細胞的氧化損傷，來延緩DPN的發生與發展。

參考文獻4

1Kamei J，Ohhashi Y，Aoki T，etal.Streptozotocin-induced diabetes in mice reduces the nociceptive threhold，as recognized after application of noxious mechanical stimuti but not of thermal stimuli〔J〕.Pharmacol Biochem Behav，1991；39(2)：541-4.

2Wu YB，Shi LL，Wu YJ，etal.Protective effect of gliclazide on diabetic peripheral neuropathy through Drp-1 mediated-oxidative stress and apoptosis〔J〕.Neurosci Lett，2012；523(1)：45-9.

3Kellogg AP，Cheng HT，Pop-Busui R.Cyclooxygenase-2 pathway as a potential therapeutic target in diabetic peripheral neuropathy〔J〕.Curr Drug Targets，2008；9(1)：68-76.

4Sima AA.Pathological mechanisms involved in diabetic neuropathy：can we slow the process〔J〕?Curr Opin Invest Drugs,2006；7(4)：324-37.

〔2014-03-21修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：韓杰(1966-)，男，醫學博士，教授，碩士生導師，主要從事神經系統疾病的臨床與基礎研究。

中圖分類號〔〕R285.5〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6072-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.029