慢阻肺大鼠肺泡灌洗液和外周血中樹突狀細(xì)胞趨化因子受體水平變化及意義

孫得勝，劉虹延,令狐陽,顧延會(huì),歐陽瑤

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院)

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·基礎(chǔ)研究·

慢阻肺大鼠肺泡灌洗液和外周血中樹突狀細(xì)胞趨化因子受體水平變化及意義

孫得勝，劉虹延1,令狐陽1,顧延會(huì),歐陽瑤1

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院)

摘要：目的觀察慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)大鼠肺泡灌洗液(BALF)和外周血中樹突狀細(xì)胞趨化因子受體(CCR)6、CCR7水平變化，并探討其臨床意義。方法 將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組、慢阻肺模型組、CCL20單抗組各10只，后兩組用氣道內(nèi)注入脂多糖聯(lián)合煙霧刺激的方法誘導(dǎo)慢阻肺模型，CCL20單抗組在造模前腹腔注射CCL20單克隆抗體。造模第29天觀察大鼠肺組織病理變化，用ELISA法檢測BALF及外周血中CCR6、CCR7水平。結(jié)果慢阻肺模型組肺組織HE染色符合慢阻肺的典型病理表現(xiàn)，CCL20單抗組肺部病理變化比慢阻肺模型組減輕。慢阻肺模型組BALF中CCR6水平高于對照組、CCL20單抗組(P均<0.05)，BALF中CCR7水平低于對照組(P<0.05)；而CCL20單抗組BALF中CCR7水平與慢阻肺模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組外周血中CCR6、CCR7水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 慢阻肺大鼠BALF中CCR6水平升高、CCR7水平降低，而外周血中CCR6、CCR7水平變化不明顯，CCL20單抗可抑制CCR6水平升高以減輕病情。

關(guān)鍵詞：慢性阻塞性肺疾病；樹突狀細(xì)胞；趨化因子受體6；趨化因子受體7；大鼠

慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)全球倡議認(rèn)為氣道和肺組織對有害氣體或顆粒的異常炎癥反應(yīng)是其重要特征[1]。在慢阻肺的炎癥反應(yīng)過程中有免疫細(xì)胞被募集到肺[2]。慢阻肺中的免疫應(yīng)答是在特定的抗原驅(qū)使下完成的[2]，同時(shí)受樹突狀細(xì)胞(DC)的嚴(yán)密調(diào)控[3]。在外來抗原侵襲機(jī)體時(shí)，DC從完好的上皮組織移行到受侵襲的部位并攝取這些抗原[4]。DC繼續(xù)遷移到局部引流淋巴結(jié)，提呈所攝取的抗原給相關(guān)的T細(xì)胞。DC的遷移在其趨化因子受體(CCR)與相關(guān)的趨化因子間的相互作用下完成[5]。我們于2011年5月~2014年12月，檢測慢阻肺大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)及外周血中DC的CCR6、CCR7水平，探討其臨床意義。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)雄性Wistar大鼠30只(由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，出生56 d，體質(zhì)量200~220 g。Monoclonal Anti-rat CCL20 Antibody(R&D Systems公司)，大鼠CCR6、CCR7 ELISA試劑盒(上海西唐生物科技公司)，LPS(Sigma公司)，香煙(煙氣煙堿量1.2 mg、焦油13 mg、煙氣一氧化碳14 mg，遵義牌，貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司)。

1.2模型建立將大鼠隨機(jī)分為對照組、慢阻肺模型組和CCL20單抗干預(yù)組，各10只。根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]制備慢阻肺模型。分別于第1、15天大鼠氣道內(nèi)注入細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)溶液內(nèi)被動(dòng)吸煙(每天2次，每次間隔2 h，每次燃12支香煙)。對照組不予上述處理，CCL20單抗組大鼠第1天注入LPS前腹腔注射CCL20單克隆抗體100 μg。

1.3支氣管肺泡灌洗液(BALF)及外周血中CCR6、CCR7檢測造模第29天選取各組大鼠用直徑約1 mm的毛細(xì)管從大鼠內(nèi)毗球后靜脈采集1 mL血，離心后取上清。大鼠麻醉后開胸，結(jié)扎右肺，剪取右肺下葉予多聚甲醛固定，制作石蠟標(biāo)本及病理切片，并行HE染色，鏡下觀察肺組織病理變化。取右肺上葉放入低溫冷凍管，并保存?zhèn)溆?。在大鼠氣管下段作一倒“T”形切口，插入內(nèi)徑約1 mm的塑料管，用注射器緩慢注入4 ℃生理鹽水5 mL，并輕柔按摩大鼠肺臟行支氣管肺泡灌洗3次，將回抽的灌洗液保存，采用ELISA法檢測各組BALF及外周血中CCR6、CCR7。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取平均值。

2結(jié)果

2.1各組肺組織病理變化對照組肺泡結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，肺泡壁完好，小支氣管未見炎性細(xì)胞浸潤及腺體。慢阻肺模型組部分肺泡間隔增寬，在增寬的肺泡間隔內(nèi)可看到毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，并伴有淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤；部分肺泡間隔出現(xiàn)變窄、斷裂甚至融合，符合慢阻肺的特征性病理表現(xiàn)特點(diǎn)。CCL20單抗組肺泡腔稍增大，伴有肺泡間隔增寬，可見炎性細(xì)胞的浸潤，但與慢阻肺模型組相比其病理改變的程度顯著減輕。

2.2各組BALF及外周血中CCR6、CCR7水平比較見表1。

表1　各組BALF及外周血中CCR6、

注：與對照組比較，*P<0.05；與慢阻肺模型組比較，#P<0.05。

3討論

慢阻肺是以不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限為特征的氣道慢性炎癥性疾病，吸煙和感染被公認(rèn)是引起慢阻肺發(fā)病的最主要的環(huán)境因素。我們對大鼠進(jìn)行煙霧刺激并注射LPS誘發(fā)感染以模擬這種病理生理過程，28 d后慢阻肺模型組病理改變結(jié)果與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致，符合慢阻肺病理的特征性表現(xiàn)；而CCL20單抗組大鼠肺部病理表現(xiàn)比慢阻肺模型組明顯減輕。

本研究結(jié)果表明，慢阻肺大鼠BALF中CCR6的水平均較對照組增多。CCR6是未成熟DC(iDC)的CCR[7]，作為與iDC緊密相連的CCR6可看作iDC自身結(jié)構(gòu)的一部分，當(dāng)氣道發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，在炎癥介質(zhì)的刺激下，部分CCR6帶動(dòng)iDC從其“儲(chǔ)備庫”向肺部遷移[8]，故而可引起肺部iDC和CCR6的增多。CCL20是CCR6的配體[9]，二者相互作用被認(rèn)為是iDC被募集的一個(gè)可能的重要機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，CCL20單抗組BALF中CCR6水平低于慢阻肺模型組(P<0.05)。這很可能由于CCL20抗體結(jié)合了大量的CCL20，從而使能與CCR6相互作用的CCL20顯著減少，致使被趨化到肺部的CCR6減少，同時(shí)也使慢阻肺病情減輕。BALF中CCR7水平比較，慢阻肺模型組低于對照組，CCL20單抗組與慢阻肺模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這是因?yàn)镃CR7是成熟DC的受體[10]，其配體是CCL19和CCL21[11]，而不是CCL20，所以注射該單抗后對體內(nèi)的CCR7并沒有發(fā)生直接的作用。本研究中各組外周血中CCR6、CCR7水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，原因可能為趨化活動(dòng)中發(fā)生遷移的CCR的數(shù)量與外周血內(nèi)的總量比太少，所以對外周血中CCR6、CCR7的水平?jīng)]有產(chǎn)生明顯的影響。

總之，慢阻肺的發(fā)病可能與肺部CCR6水平升高及CCR7水平降低有關(guān)，使用CCL20單抗能部分抑制這一效應(yīng)，使病情減輕。然而，在慢阻肺的炎癥反應(yīng)中多種CCR起著調(diào)控作用，需要同時(shí)抑制多種CCR才能達(dá)到理想的治療效果，有待于以后的研究中進(jìn)一步探索。

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(收稿日期：2015-12-11)

中圖分類號(hào)：R563

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)09-0024-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.008

通信作者：歐陽瑤(E-mail：ouyangyao116@sohu.com)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460008)。