DEC1參與順鉑誘導食管鱗癌的細胞衰老

邵琳琳　趙佳佳　朱圣韜　郭水龍　張澍田　孫秀梅　王擁軍

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院消化內科　國家消化系統疾病臨床醫學研究中心　首都醫科大學消化病學系　消化疾病癌前病變北京市重點實驗室，北京 100050)

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DEC1參與順鉑誘導食管鱗癌的細胞衰老

邵琳琳趙佳佳朱圣韜郭水龍張澍田孫秀梅王擁軍*

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院消化內科國家消化系統疾病臨床醫學研究中心首都醫科大學消化病學系消化疾病癌前病變北京市重點實驗室，北京 100050)

【摘要】目的探究化學治療藥物順鉑對食管鱗癌細胞衰老的影響及其機制。方法檢測4種食管鱗癌細胞株(ECA109、EC9706、TE-1、TE-3)和一株正常的人類永生化食管上皮細胞株(Het-1a)中細胞衰老因子p53、分化型胚胎軟骨發育基因1(differentiated embryo-chondrocyteexpressed gene1， DEC1)的mRNA和蛋白的表達情況；選取TE-3為研究對象，采用MTT方法檢測不同濃度的順鉑(2、4、6、8、10 μmol/L)對TE-3增生的情況，并結合衰老相關的β半乳糖苷酶染色方法，篩選出誘導細胞衰老的最適濃度。以順鉑最適濃度(4 μmol/L)作用TE-3 48 h，采用Western blotting方法檢測順鉑作用前后p53、DEC1蛋白水平的表達情況。結果檢測食管鱗癌細胞系中細胞衰老因子p53、DEC1的mRNA和蛋白的表達，發現食管鱗癌細胞與食管上皮細胞相比，p53的表達均有不同程度下降，DEC1的表達均有不同程度升高。用不同濃度的順鉑(2、4、6、8、10 μmol/L)作用TE3，MTT顯示順鉑對細胞TE-3的增生抑制作用呈劑量和時間依賴性；結合衰老相關的β半乳糖苷酶染色，發現順鉑可誘導TE-3出現細胞衰老，并在順鉑4 μmol/L作用48 h時細胞衰老現象最明顯；在順鉑4 μmol/L作用TE-3細胞48 h檢測對照組與實驗組的p53、DEC1的蛋白表達情況，發現實驗組中TE-3的p53、DEC1的表達量分別升高了4.6倍(P=0.040)、2倍(P=0.032)。結論順鉑可誘導食管鱗癌細胞呈現細胞衰老表型，細胞衰老相關基因p53和DEC1可能參與這一過程。

【關鍵詞】食管鱗癌；細胞衰老；DEC1；p53；順鉑

食管癌是常見惡性腫瘤之一，在全世界范圍內發病率高，惡性程度高，病程進展快，預后較差，患者的生存率低。我國是食管癌發病率和病死率最高的國家，每年全世界新增的30萬食管癌患者中， 約有一半發生在中國，而食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma， ESCC，以下簡稱食管磷癌)占90%以上[1-2]。細胞衰老是細胞生長永久受抑制的狀態，是對于非致命性刺激的一種應答，這些刺激包括癌基因的激活、DNA 損傷、氧化應激(reactive oxygen species， ROS)、抗腫瘤藥物等；細胞衰老能夠防止老化的或非正常細胞的進一步生長，對抗細胞的無限增生能力而對機體起到保護作用[3]。順鉑是食管癌的常用化學治療藥物，順鉑可誘導鼻咽癌、肺癌等發生細胞衰老。對于食管鱗癌的細胞衰老及順鉑對食管鱗癌的細胞衰老的作用尚不清楚。

1材料和方法

1.1 材料

人食管癌細胞株TE-1、TE-3、ECA109、ECA9706；正常食管永生化上皮Het-1A細胞系(本實驗室傳代留存)，胎牛血清(美國Gibco公司)；RPMI-1640 培養基(美國Gibco公司)；MTT(美國Sigma公司)；p53、DEC1抗體(美國Cell Signaling公司)；辣根酶過氧化物標記的二抗(美國Santa Cruz 公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及藥物處理

人食管癌TE-1、TE-3、ECA109、ECA9706細胞系培養環境相似，為37 ℃、5%(體積分數)CO2的孵箱。培養液為含10%(體積分數)胎牛血清的RPMI1640，順鉑質量濃度為200 μg/mL。

1.2.2MTT法檢測細胞體外藥物敏感性

取5×103個細胞，均勻種植于Corning公司的96孔板中，代細胞貼壁后，按照不同的順鉑濃度加藥，每個濃度設置5個復孔。培養0、24、48、72 h后，向96孔板的每個孔小心加入5 mg/mL的預制MTT溶液20 μL，繼續孵育2 h。小心吸出96孔板孔內液體，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩器上震搖10 min，使用酶標儀在490 nm波長處讀出各孔的吸光度值。根據所得結果，以對照組的吸光度值為參照，計算與對照組的比值并繪制藥物濃度抑制曲線。

1.2.3Western blotting 法分析蛋白表達

不同條件處理食管癌細胞后，棄去培養液，PBS洗2次，把PBS 液吸取干凈后，加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和細胞裂解液，冰上孵育15 min，用細胞刮將細胞刮下收集到1.5 mL的EP管中，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，吸取上清至另一EP管。BCA法檢測蛋白濃度，在樣品中加入SDS-PAGE loading buffer，100 ℃煮沸10 min，冷凍保存備用。各組樣品采取總蛋白30 μg，經SDS-PAGE電泳，轉膜至PVDF膜后封閉，一抗過夜，次日加入辣根酶過氧化物標記的二抗，室溫孵育1 h，加入ECL 底物，用Bio-Rad成像系統對化學發光信號進行圖像采集，采用Quantity One 軟件比較樣本目的蛋白表達水平高低。

1.2.4衰老相關的β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色

取對數生長期的TE-3細胞接種6孔板，細胞濃度為3×104/孔，在不同濃度順鉑處理細胞48 h后，鏡下觀察細胞形態發生明顯變化，按照SA-β-gal試劑盒說明書在孔板內進行SA-β-gal原位染色。(1)吸棄細胞培養液，用PBS洗滌2次；加入1 mL SA-β-gal固定液，室溫固定15 min。(2)吸除固定液，用PBS洗2次，每次5 min；(3)吸除固定液，每孔加入1 mL 染色工作液。(4)37 ℃無CO2培養箱孵育過夜，用保鮮膜封住6孔板防止蒸發；(5)顯微鏡下觀察，在細胞質內出現均勻一致的藍色顆粒為SA-β-gal陽性。

1.3統計學方法

2結果

2.1檢測p53和DEC1在ESCC細胞株及正常食管上皮細胞中mRNA的表達情況

采用RT-PCR方法檢測在4種食管鱗癌細胞株ECA109、EC9706、TE-1、TE-3和一株永生化食管上皮細胞株Het-1a中的p53、DEC1 mRNA的表達。結果如圖1所示，各細胞株均可見p53不同程度的表達，其中食管癌細胞株TE-1、TE-3和正常食管上皮細胞株Het-1a中，p53(117bp)表達相對較高，DEC1(339bp)在EC9706、TE-1、TE-3中呈高表達。各細胞株均可見GAPDH(309bp)條帶。該結果提示p53、DEC1在正常食管上皮以及不同分化程度食管鱗癌細胞轉錄水平差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2檢測p53和DEC1在ESCC細胞株及正常食管上皮細胞中蛋白的表達情況

采用Western blotting方法檢測4種食管鱗癌細胞株ECA109、EC9706、TE-1、TE-3和一株永生化正常食管上皮細胞株Het-1a中P53、DEC1蛋白的表達。結果如圖2所示，P53蛋白在TE-1、TE-3、Het-1a中高表達，在ECA109、EC9706中低表達；而DEC1在TE-1、TE-3、EC9706相對高表達，在ECA109、Het-1a相對低表達，各細胞株均可見β-actin表達。與正常食管永生化細胞株Het-1a相比，P53在ESCC細胞中的表達有不同程度的降低；而DEC1在ESCC細胞表達有不同程度的升高。

2.3MTT檢測不同濃度順鉑對食管癌細胞株TE-3增生的影響

以TE-3為研究對象用順鉑進行干預。分別用順鉑2、4、6、8、10 μmol/L處理TE-3細胞24 h后，將培養基更換為不含藥物的全培養基，繼續培養72 h，分別于給藥后0、24、48、72、96 h觀察細胞形態及檢測細胞增生情況。與空白對照組相比，隨著藥物濃度及培養時間增加，細胞增生的抑制明顯增加(0.550±0.275，n=6，P=0.000， 圖3)。在對照組，細胞形態呈圓形或者短梭形，細胞核為圓形或橢圓形，胞質豐富；在低劑量順鉑組(4和 6 μmol/L)，細胞體積增大扁平，胞質中空泡增多；在高劑量順鉑組(8和10 μmol/L)，可見細胞變小變圓，數量減少。在4 μmol/L時，細胞增長曲線基本為水平線，即細胞未見明顯增生，此時為誘導細胞衰老的最佳濃度；選取順鉑濃度為4 μmol/L為最佳誘導細胞衰老濃度，進行后續試驗。

圖1　DEC1、p53在永生化食管上皮細胞株Het-1a和食管鱗癌細胞株中ECA109、EC9706、TE-1、TE-3的mRNA表達

圖2　DEC1、p53在永生化食管上皮細胞株Het-1a和食管鱗癌細胞株中ECA109、EC9706、TE-1、TE-3的蛋白的表達

圖3　MTT檢測不同濃度順鉑對食管癌

2.4衰老相關的β半乳糖苷酶染色檢測食管癌細胞株TE-3衰老情況

SA-β-gal是常用的用于檢測細胞衰老的標志物，在實驗中用于檢測不同濃度順鉑作用下細胞的衰老情況。順鉑濃度4 μmol/L作用TE-3細胞48 h后，細胞體積變大，胞質內空泡增多，突觸增多變長，70%以上衰老相關β半乳糖苷酶染色陽性，呈現出細胞衰老

表型；而在8 μmol/L和10 μmol/L濃度的順鉑作用下，TE-3細胞大量死亡，數量明顯減少，細胞體積變小，在作用96 h后，只有少數完整細胞(圖4)。因此，低劑量的順鉑可使食管鱗癌細胞發生衰老，而高劑量的藥則導致細胞死亡，選取順鉑濃度4 μmol/L作用時間為48 h進行后續實驗。

2.5順鉑作用TE-3檢測細胞衰老前后P53、DEC1的變化情況

順鉑可損傷DNA導致細胞凋亡，也可通過損傷DNA 而誘導細胞的加速性衰老。采用Western blotting法檢測順鉑4 μmol/L作用前后細胞中DEC1、P53表達情況，結果顯示，TE-3：順鉑作用48 h時，實驗組中(48D)p53蛋白表達量較對照組(48C)升高 (P=0.029)，實驗組中(48D)DEC1表達量較對照組(48C)升高(P=0.020)，差異具有統計學意義 (P<0.05，圖5)。

圖4　不同濃度順鉑對食管癌細胞株TE-3作用及TE-3經順鉑處理后衰老相關的β半乳糖苷酶染色

圖5　順鉑處理前后p53、DEC1蛋白表達變化

48C: 48 h in negative control； 48D: 48 h in the group of cisplatin；*P<0.05,**P<0.01vs48C;DEC1: differentiated embryo-chondrocyte-expressed gene1.

3討 論

野生型p53基因，是最重要的腫瘤抑制因子之一，p53可在DNA損傷、ROS產生、端粒酶失活等因素作用下被激活。P53蛋白通過與其基因內部或上游的p53反應元件相結合的方式反式激活相應基因的轉錄，導致細胞周期停滯、細胞衰老和凋亡。分化型胚胎軟骨發育基因1(differentiated embryo-chondrocyteexpressedgene1，DEC1) 定位于人類染色體3p25. 3-26 上，含有堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)結構域[4]，它屬于轉錄因子，能夠抑制多種細胞系的細胞增生，DEC1在腫瘤組織中也有表達，如胰腺癌[5]、口腔癌[6]、胃癌[7]、腎癌等。CHIP 技術分析p53與DEC1基因的啟動子相結合，通過p53反應元件從轉錄水平調節DEC1。另外，DEC1 的過表達是通過誘導細胞停滯在G1 期而促進細胞衰老。因此認為，DEC1在DNA損傷誘導的早衰分子機制中可能屬于p53的下游因子。

順鉑作為上皮來源腫瘤的一線類化學治療藥物，在臨床上得到廣泛的應用，包括：肺癌、卵巢癌、睪丸癌、膀胱癌、頭頸部癌等。作用機制主要是與DNA上的核堿鳥嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶形成DNA單鏈內兩點的交叉聯結，也可以形成雙鏈間的交叉聯結，從而破壞DNA的結構和功能來起到促進細胞凋亡，來起到破壞腫瘤的作用，除此之外，指出順鉑能激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK))信號通路途徑，進而參與到細胞周期相關的調控中，在一些腫瘤中呈現出細胞衰老樣的形態變化。大劑量的順鉑導致細胞凋亡，低劑量順鉑可致DNA損傷，有可能參與ESCC的細胞衰老。

細胞衰老是細胞對非致命性刺激的一種應答，這些刺激包括癌基因的激活、DNA 損傷、氧化應激、抗腫瘤藥物等；細胞衰老能夠防止老化的或非正常細胞的進一步生長，對抗細胞的無限增生能力而對機體起到保護作用[8]。衰老的細胞仍具有生活學活性，但是細胞的基因和蛋白的表達譜發生了很大變化，使其只能維持基本代謝過程，而缺乏合成DNA和細胞增生的能力[9]，即使是在分裂素的刺激下。細胞衰老存在相應的標志物。目前廣泛應用的，且特異性較高的為衰老相關β-半乳糖苷酶染色[10-12]，是指在pH為6時，衰老細胞內溶酶體活動，進而溶酶體水解酶增加，與x-gal反應生成的藍色物質增多，聚集在胞質內，使細胞質呈現藍色。此外衰老相關的異染色質聚集(senescence-associated heterochromatin foci，SAHF)是與衰老相關的表觀遺傳學上的改變，也可用于提示細胞衰老的存在[13-14]。

在食管鱗癌細胞株和食管永生化正常細胞株中分別從mRNA、蛋白水平檢測p53、DEC1表達，P53在食管鱗癌細胞株中表達較食管永生化細胞株下降，DEC1表達則升高；而在同一細胞系列TE中，對于p53野生型及突變型，p53、DEC1表達結果也存在差異。因此，在不同的食管鱗癌細胞系中，p53、DEC1的表達存在差異。采用不用濃度的順鉑作用于TE-3，觀察24、48、72、96 h時細胞的形態學及p53、DEC1的蛋白水平均發生改變。TE-3中，順鉑濃度為2 μmol/L時，隨著細胞培養時間的延長，細胞數目逐漸增加，未見到明顯的細胞增生抑制的現象，行衰老相關β-半乳糖苷酶染色，部分細胞呈現衰老相關表型；對于順鉑為4、6、8、10 μmol/L時隨著培養時間的延長，細胞數目成下降趨勢，而且細胞形態發生明顯變化，細胞體積變大，突起增多，胞質內空泡增多，衰老相關β-半乳糖苷酶染色示胞質藍染；在順鉑濃度為4 μmol/L，作用48 h時，上述形態學改變及衰老相關β-半乳糖苷酶染色最明顯。因此，順鉑可使食管鱗癌細胞呈現增生抑制、細胞衰老的現象，且在一定濃度作用下，呈現出劑量和時間依賴性。

本研究表明，低劑量順鉑濃度4 μmol/L可誘導TE-3發生細胞衰老，表現為細胞體積變大，突起增多，胞質內空泡增多，衰老相關β-半乳糖苷酶染色陽性率高，并且細胞數目成下降趨勢。此外，低劑量順鉑作用下p53、DEC1表達均發生改變，表明低濃度的順鉑可誘導食管鱗癌細胞發生衰老，且p53、DEC1可能參與這一過程。

總之，細胞衰老作為腫瘤發生發展的天然屏障，可以在化學治療藥物所致的應激狀態下而得以呈現。化療藥物在晚期腫瘤的治療中占據重要地位，主要通過誘導細胞凋亡而抑制細胞增生甚至消滅腫瘤細胞。本研究發現化療藥物可誘導ESCC表現出細胞衰老，而起到抑制細胞增生的作用；同時在誘導腫瘤細胞衰老的過程中，細胞衰老標志物還可能為腫瘤治療的療效判斷及預后估計提供重要信息；就這兩點而言，細胞衰老的相關研究為腫瘤的治療提供了新的思路和方法。但是，還有一種觀點認為，衰老的腫瘤細胞可以釋放衰老相關分泌因子，如IL-6等，反而促進腫瘤的發生及發展，因此深入了解衰老腫瘤細胞發生機制的也是一重大命題，同樣值得關注及進一步探索。

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編輯慕萌

Association of DEC1 and cellular senescence of esophageal squamous cell carcinoma induced by cisplatin

Shao Linlin， Zhao Jiajia, Zhu Shengtao，Guo Shuilong，Zhang Shutian， Sun Xiumei， Wang Yongjun*

(DepartmentofGastroenterology，BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity；NationalClinicalResearchCenterforDigestiveDiseases；FacultyofGastroenterologyofCapitalMedicalUniversity；BeijingKeyLaboratoryforPrecancerousLesionofDigestiveDiseases，Beijing100050，China)

【Abstract】Objective To investigate whether cisplatin could induce senescence in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).MethodsFour ESCC cell lines (ECA109， EC9706， TE-1， TE-3)and one normal esophageal epithelial cell line (Het-1a) were analyzed for this study. Reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting were employed to detect the mRNA and protein expression of p53 and differentiated embryo-chondrocyte-expressed gene1 (DEC1) in ESCC cell lines. MTT and senescence associated β-galactosidase were used to explore an appropriate cisplatin concentration to induce proliferation inhibition and cellular senescence in TE-3 cell line. Further， Western blotting was employed to detect the expression of DEC1 and p53.ResultsIn this study， we identified that p53 had a lower expression compared with normal esophageal epithelial cells by testing mRNA and protein expression of different esophageal cancer cell lines， while the expression of DEC1 had a higher expression. MTT assay showed that cisplatin inhibited the growth of TE-3 in a dose-and time-dependent manner. Combined MTT with senescence associated β-galactosidase， 4uM and 48 hours were chosen as most appropriate condition to induce cellular senescence. Elevated levels of senescence associated β-galactosidase were observed in TE-3 cells when exposed to low doses of cisplatin. TE3 cell experienced morphological changes following drug exposure accompanied with up regulation of DEC1 and p53.ConclusionOur results revealed that cisplatin could induce cellular senescence in esophageal squamous cell carcinoma. Meanwhile， p53 and DEC1 may be involved in this process.

【Key words】esophageal squamous cell carcinoma；cellular senescence； DEC1；p53；cisplatin

(收稿日期：2015-12-25)

【中圖分類號】R 655.4

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.004]

*Corresponding author， E-mail：wyj_30302@163.com

基金項目：國家自然科學基金(81302160， 81272447)， 國家消化系統疾病臨床醫學研究中心基金(2015BAI13B09)。 This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81302160， 81272447)， National Clinical Research Center for Digestive Diseases (2015BAI13B09).

網絡出版時間：2016-01-2718∶10網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20160127.1810.042.html

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