中國AML人群CEBPa、NPM1、FLT3-ITD基因突變發生率檢測*

廖長風，劉禮平，賴文鴻，林傳明，李海亮

(贛南醫學院第一附屬醫院血液內科，江西　贛州　341000)

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中國AML人群CEBPa、NPM1、FLT3-ITD基因突變發生率檢測*

廖長風，劉禮平，賴文鴻，林傳明，李海亮

(贛南醫學院第一附屬醫院血液內科，江西贛州341000)

摘要：目的：回顧性分析大量病例的基因檢測結果，闡述CEBPa、NPM1及FLT3-ITD這三種最常見的AML突變基因在中國人群中的發生率。方法：本研究總共從全國25家醫院收集了878例AML成年患者的標本(包括骨髓和外周全血)的CEBPa、NPM1、FLT3-ITD基因突變檢測的結果。結果：共檢測出103例(11.7%)CEBPA基因突變，79例(9.0%)NPM1基因突變，以及71例(8.1%)FLT3-ITD基因突變陽性患者。在71例ITD基因突變陽性患者中，29例(40.8%)患者同時檢測到NPM1基因突變陽性，12例(16.9%)患者同時有CEBPA基因突變。結論：本研究發現中國AML人群中CEBPA、NPM1和FLT3-ITD基因突變的發生率和國外文獻報道的數據有所不同，為進一步探索其潛在原因提供了初步的數據依據。

關鍵詞：突變基因；急性髓系白血病；發生率；中國

急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)是髓系原始細胞克隆性增生疾病，是造血前體細胞發生的一系列基因改變的結果。這些變化會引起造血細胞發生和分化的異常，從而導致大量不成熟的髓樣細胞在骨髓和外周血中的出現和積累。這些異常細胞能夠分裂和增殖，但不能分化成成熟的血細胞(即嗜中性粒細胞)。基因測序研究表明，原發性AML病例平均包含超過10個顯著的基因突變。其中最常見的突變基因包括：FLT3(28%)，NPM1(27%)，DNMT3A(26%)，IDH1或IDH2(20%)，NRAS或KRAS基因(12%)，RUNX1(10%)，TET2(8%)，TP53(8%)，CEBPA(6%)和WT1(6%)。確定突變基因對判斷AML患者的預后有相當的意義，并且影響治療計劃的選擇[1]。本研究課題回顧性的分析了在878名AML患者中三種基因突變的發生情況，包括CEBPA (CCAAT enhancer-binding protein alpha)、NPM1 (Nucleophosmin)和FLT3-ITD(Fms-like tyrosine kinase 3-Internal tandem duplications)。

1材料和方法

1.1研究對象從2012年8月到2014年4月，我們回顧性研究了來自于全國25家醫院急性髓系白血病(AML)成年患者的標本(包括骨髓和外周全血)的CEBPa、NPM1、FLT3-ITD基因突變檢測的結果。AML的診斷依據血液病診斷與療效標準第三版[2]。

1.2基因組 DNA 的制備取患者初診時凍存的骨髓或外周血2～3 mL。采用DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司產品)提取基因組DNA，測定吸光度A260 nm/A280 nm值確定DNA產物的濃度，用去離子水稀釋基因組DNA樣品至50～150 ng·μL-1。

1.3PCR 擴增

1.3.1CEPBa基因擴增PCR 總體系 20 μL ，包括模板 DNA 3 μL、擴增反應液17 μL (上海源奇生物醫藥科技有限公司相關基因檢測產品)。PCR條件：42 ℃ 5 min；94 ℃，5 min；(94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min)40個循環；72 ℃延伸5 min；產物4 ℃保持。反應液A的擴增片段大小在570 bp，反應液B的擴增片段大小在675 bp。

1.3.2FLT3-ITD和NPM1基因擴增PCR 總體系25 μL，包括模板DNA 3 μL、 擴增反應液22 μL(上海源奇生物醫藥科技有限公司相關基因檢測產品)。PCR條件：42 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min (94 ℃ 15 s；60 ℃ 25 s；72 ℃ 1 min)40個循環；72 ℃延伸5 min；產物4 ℃保持。FLT3-ITD基因擴增片段大小450 bp，NPM1基因擴增片段大小250 bp。

1.4基因擴增產物序列分析使用測序產物純化試劑及測序試劑(上海源奇生物醫藥科技有限公司產品)對擴增符合要求的PCR產物進行酶解、測序PCR及純化。酶解PCR反應體系7 μL: PCR產物5 μL+2 μL SAP，混勻；PCR條件:37 ℃ 60 min;80 ℃ 15 min;產物 4 ℃存。測序PCR反應體系6 μL:PCR 酶解產物3 μL+1 μL測序劑(bigdye) +2 μL測序引物;PCR條件:96 ℃ 1 min(96 ℃ 10 s;50 ℃ 5 s;60 ℃ 4 min)30個循環;產物4 ℃保存。測序產物純化采用標準的酒精/EDTA/NaAc法，用Applied Biosystems 3130測序儀(美國應用生物系統公司中國公司)通過毛細管電泳對純化好的產物進行測序，運用Chromas軟件分析測序結果。分別檢測NPMl基因第12外顯子基因的插入、FLT3-lTD基因第14和15號外顯子基因的插入及CEBPa基因的插入缺失突變情況。

2結果

2.1一般資料本研究總共從全國25家醫院收集了878例AML成年患者的標本(包括骨髓和外周全血)的CEBPA、NPM1、FLT3-ITD基因突變檢測的結果。其中男性患者582名(66.3%)，女性患者296名(33.7%)。平均年齡64.1歲(20歲到79歲)。

2.2CEBPA、NPM1及FLT3-ITD基因突變測序的結果878例AML病例中，共檢測出103例(11.7%)CEBPA基因突變陽性患者，79例(9.0%)NPM1基因突變陽性患者，71例(8.1%)FLT3-ITD基因突變陽性患者。在71例ITD基因突變陽性患者中，29例(40.8%)患者同時檢測到NPM1基因突變陽性，12例(16.9%)患者同時有CEBPA基因突變。有兩個基因突變陽性的患者占到總患者人群的4.7%(41例)見圖1。

箭頭所示為突變發生的位點。

3討論

FLT3是一種跨膜的絡氨酸酶受體，它的激活會刺激細胞的增殖。FLT3基因突變已經被公認為AML中發生率最高的一種基因改變，其中最常見的突變為內部串聯復制 (FLT3-ITD)。FLT3-ITD的突變以及其導致的FLT3受體絡氨酸激酶的激活在AML患者中非常常見，特別是在正常核型的患者中[3]。FLT3-ITD 為FLT3突變的主要表現形式，國外報道FLT3-ITD在 AML 中的發生率約為 20%[3-5]，而在 AML-NK 中突變頻率為 28%～34%[6]。本研究AML患者中FLT3-ITD檢測的突變率為8.1%，低于國內其他報道[7]，可能本研究樣本來自于多地區中心人群相關，各地區樣本量的不均一可能會導致檢測出的突變率有差異，更大樣本量及分區域的數據分析能協助了解區域性差異。FLT3-ITD的突變和兒童和年輕AML患者的較差的預后有直接相關，同時與接收高密度化療的老年患者的較差的預后也密切相關[8-12]。Marcucci和Schlenk的研究分別發現，FLT3-ITD的AML患者，其2年無病生存率和4年總體生存率均為20%[9，13]。

核仁磷酸蛋白 (Nucleophosmin gene) NPM1 是一種廣泛表達的磷蛋白，通常穿梭于細胞核和胞質之間，參與核糖體蛋白的組裝、轉運，以及腫瘤抑制基因ARF的調控[14]。NPM1基因位于第5號染色體 q35[14]，其基因突變是急性髓系白血病的一種特異性表現，其發生率在正常核型的成人急性髓系白血病(AML-NK)患者中約為50%～60%[15]。NPM1基因突變通常與更好的AML預后相關[16]。 伴有NPM1基因突變的患者對化療藥物誘導的緩解敏感，因此Schnittger等提出可以將NPM1突變陽性作為預測AML的預后良好的指標之一[17]。

CEBPA基因編碼CCAAT增強子結合蛋白(CCAAT enhancer binding protein alpha)，一種粒細胞分化因子，是轉錄因子家族中的重要成員，在髓系分化中起著重要作用[18-19]。CEBPA在AML中的發生比例約為5%～14%[20]。本研究檢測的AML人群中CEBPA突變的發生為11.7%，與先前的中國人群研究一致[21-22]。CEPBA突變可分為2種形式：(1)C-端發生突變對基本區域進行干擾，進而影響DNA結合。該突變形式存在于大多數AML患者中；(2)N-端突變，由于不能形成完整的42 KD蛋白質，因此引發細胞增殖[23]。目前研究表明，CEBPA 基因突變可以作為一個獨立的預后良好的指標[23]，在AML的患者中，與CEBPA沒有突變的患者相比， CEBPA突變的患者總生存期較長[20，24]。還有研究表明，若有兩種基因同時發生突變，對AML患者的預后將會發生較大的影響[24]。

在本研究中，我們在AML患者中共檢測出4.7%的病例(41例)有兩個基因的突變，其中包括29名患者同時檢測到FLT3-ITD和NPM1基因突變陽性，以及12例患者同時有FLT3-ITD和CEBPA基因突變。NPM1 突變經常同FLT3-ITD突變一起發生，很少伴隨其他突變發生，并且NPM1+/FLT3-ITD患者的預后良好，提示NPM1+是NK-AML患者獨立的良好預后因素[25]。但研究表明，伴有FLT3-ITD陽性的患者 NPM1突變不能改變其不良的預后[26]。而CEBPA突變患者往往同時存在FLT3-ITD突變[24]，FLT3-ITD突變能夠降低患者的總生存期，因此單純CEBPA突變的AML患者預后較好，若同時伴隨FLT3-ITD突變，將會影響AML患者對化療藥物誘導的緩解效果，預后仍然不佳[26]。

本回顧性研究對多中心和大量病例的基因檢測結果進行了分析，闡述了CEBPA、NPM1及FLT3-ITD這三種最常見的AML突變基因在中國人群中的發生率。

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Detection of Gene Mutation Rate of CEBPa, NPM1 and FLT3-ITD in Patients with Acute Myeloid Leukemia in China

LIAOChang-feng,LIULi-ping,LAIWen-hong,LINChuan-ming,LIHai-liang

(Dept.ofInternalMedicineofHematology,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Abstract:Objective:To analyze retrospectively the results of gene detection in a large number of cases and to describe the incidence of gene mutation of CEBPa, NPM1 and FLT3-ITD, three most common AML mutations, in the Chinese population. Methods:CEBPa,PM1,FLT3-ITD mutation detection in adult patients of 878 cases with AML were collected from 25 hospitals.Results:103 cases (11.7%) of CEBPA mutations,79 cases (9%) of NPM1 mutations, and 71 cases (8.1%) of FLT3-ITD mutation were detected to be positive. In the 71 positive ITD mutation patients, 29(40.8%) patients were simultaneously detected NPM1 mutation, and 12 patients (16.9%) had CEBPA mutation simultaneously. Conclusion:This study found CEBPA, NPM1, FLT3 gene mutation in Chinese AML population occurrence rate vary from the data reported in foreign literature. This provides preliminary data for further exploration of the underlying cause.

Key words:mutation gene;acute myeloid leukemia;incidence;China

*基金項目：江西省衛生計生委科技計劃資助項目(編號：20155410)

通訊作者：李海亮，男，學士，主任醫師，從事血液病研究。E-mail:gyfylhl@163.com

中圖分類號：Q754

文獻標志碼：A

文章編號：1001-5779(2016)02-0208-04

DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2016.02.013

(收稿日期：2015-07-15)(責任編輯：敖慧斌)