慢性阻塞性肺疾病患者支氣管肺泡灌洗液中HMGB1的表達及意義*

章俊強，梅曉冬

(安徽醫科大學附屬安徽省立醫院呼吸科，合肥 230001)

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慢性阻塞性肺疾病患者支氣管肺泡灌洗液中HMGB1的表達及意義*

章俊強，梅曉冬

(安徽醫科大學附屬安徽省立醫院呼吸科，合肥 230001)

[摘要]目的通過測定慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的支氣管肺泡灌洗液(BALF)中高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的含量并分析HMGB1和氣流受限的關系，初步探討HMGB1在COPD發病機制中的作用。方法將研究對象分為COPD組(COPD穩定期20例)和對照組(上氣道咳嗽綜合征20例)，均行支氣管鏡檢查并行支氣管肺泡灌洗術，檢測并比較兩組BALF中的細胞總數、中性粒細胞百分比；用ELISA法測定并比較兩組HMGB1、白細胞介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量，分析COPD組HMGB1和IL-1β、TNF-α間的關系及HMGB1和肺功能(FEV1%預計值)的關系。結果在BALF中，COPD組細胞總數、中性粒細胞百分比高于對照組(P<0.01)；COPD組HMGB1、IL-1β、TNF-α的含量高于對照組(P<0.01、P<0.05、P<0.01)，COPD組HMGB1的含量和IL-1β、TNF-α呈正相關(r=0.79,P<0.01及r=0.48，P<0.05)；COPD組HMGB1和肺功能值(吸入支氣管舒張劑后FEV1%預計值)呈負相關(r=-0.70,P<0.01)。結論HMGB1參與和促進COPD氣道炎癥的發生、發展，BALF中HMGB1水平和COPD嚴重程度相關。

[關鍵詞]慢性阻塞性肺疾病；高遷移率族蛋白B1；氣道炎癥

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征性病理表現為氣道慢性炎癥，其氣道內能檢測到大量炎癥細胞和炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1α、IL-1β、IL-6、IL-8等，這些早期炎癥介質對于氣道炎癥的形成和維持具有重要作用。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是一種重要的晚期炎癥因子，在炎性反應中分泌時間較晚，維持時間較長。主動分泌和被動釋放的HMGB1在復雜的炎癥網絡中扮演重要角色，在膿毒血癥、急性肺損傷、休克及自身免疫性疾病等多種疾病的發病過程中多有涉及。HMGB1在COPD 的發病機制中發揮什么作用，如何參與其中目前尚不明確，相關研究也比較少。2009年，Nassima等[1]在COPD患者外周氣道上皮組織中檢測到高表達的HMGB1，并闡述了HMGB1在COPD患者氣道炎癥形成及氣道重塑中發揮著重要作用。代靈靈等[2]在COPD患者誘導痰中的檢測到高表達的HMGB1，進一步驗證了HMGB1在COPD氣道炎癥中的作用。相比于血液和痰液等標本，支氣管肺泡灌洗液(BALF)更接近肺泡襯液，其檢測更能體現COPD氣道及肺泡本身炎癥的特征。本研究通過檢測COPD患者支氣管肺泡灌洗液中HMGB1的水平，并分析其與典型早期炎癥因子IL-1β、TNF-α的關系，初步探討HMGB1在COPD特征性炎癥中的作用，并分析HMGB1的表達和氣流受限程度的關系，進一步探索HMGB1的水平和疾病嚴重程度的關系。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1入選標準(1)COPD組：安徽省立醫院呼吸內科2010年9月至2012年12月因COPD就診的COPD穩定期病例20例。COPD穩定期指COPD患者咳嗽、咳痰、氣短等癥狀穩定或癥狀較輕，其診斷標準見中國《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2007年修訂版)[3]。(2)對照組：因亞急性或慢性咳嗽癥狀至安徽省立醫院呼吸內科門診和住院部診治的患者20例，經相應檢查診斷為上氣道咳嗽綜合征。上氣道咳嗽綜合征的診斷標準符合中國《咳嗽診治與治療指南2009版》[4]。

1.1.2排除標準合并有社區獲得性肺炎、院內獲得性肺炎、間質性肺炎、惡性腫瘤、全身嚴重感染者如敗血癥、膿毒癥、類風濕關節炎等可引起血清HMGB1升高的疾病；有纖維支氣管鏡檢查禁忌證者如嚴重低氧血癥、呼吸困難、惡性心律失常、凝血功能異常等。

1.2檢測方法征得每個患者的同意，并簽訂知情同意書后給患者行電子支氣管鏡檢查及支氣管肺泡灌洗術，收集灌洗液。支氣管肺泡灌洗術參照中華醫學會呼吸病分會2002年制定的支氣管肺泡灌洗液細胞學檢測技術規范[5]。將灌洗液離心，留取上清液于血細胞計數板中測定白細胞總數，并離心沉淀，用沉渣細胞制備細胞涂片，瑞氏染色行中性粒細胞分類計數。用酶聯免疫吸附法檢測BALF上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α的含量(ELISA試劑盒均購自美國R&D公司)，檢測方法嚴格按試劑盒說明書操作。COPD患者肺功能檢查前吸入沙丁胺醇氣霧劑200 μg，15 min后用肺功能儀(德國圣迪斯)測定第1秒用力呼氣容積(FEV1)及FEV1占預計值的百分比(FEV1%預計值)。

2結果

2.1人口學特征兩組性別、年齡、吸煙狀況無顯著差異，見表1。

2.2BALF中白細胞計數、中性粒細胞比值及各細胞因子濃度COPD組BALF中白細胞計數及中性粒細胞比值分別為(6.09±4.56)×109/L和0.44±0.15，高于對照組(1.13±0.94)×109/L和0.08±0.05，差異有統計學意義(P<0.01)；COPD組BALF中HMGB1的含量為(64.10±37.40)μg/L，顯著高于對照組[(7.79±4.46)μg/L，t=6.69，P<0.01]；COPD組BALF中IL-1β、TNF-α含量為(3.38±3.52)μg/L和(3.92±4.09)μg/L,高于對照組(1.44±1.83)μg/L和(1.18±1.53)μg/L，差異有統計學意義(P<0.05、P<0.01)，見圖1。

表1　COPD組及對照組人口學特征

圖1　BALF中白細胞計數、中性粒細胞比值及各細胞因子濃度

圖2　BALF中HMGB1含量和IL-1β、TNF-α及FEV1%預計值散點圖

2.3BALF中HMGB1含量和IL-1β、TNF-α及FEV1%預計值COPD組BALF中HMGB1的含量和IL-1β含量呈正相關(r=0.79，P<0.01)；和TNF-α呈正相關(r=0.48，P<0.05)；20例COPD患者吸入支氣管擴張劑后肺功能檢查FEV1%預計值為0.56±0.01，與BALF中HMGB1的含量呈負相關(r=-0.70，P<0.01)，見圖2。

3討論

COPD是呼吸系統疾病中重要疾病，其發病機制不甚清楚，目前認為COPD是一種以多種炎癥細胞浸潤、多種炎癥介質共同參與的氣道慢性炎癥。以IL-1β、TNF-α等為代表性的早期炎癥因子在COPD發病機制中的作用已被廣泛研究和闡述，但對于晚期炎癥因子的代表HMGB1在COPD炎癥應答中究竟起何作用目前研究甚少。有研究發現COPD支氣管肺組織中上皮細胞、炎癥細胞及平滑肌細胞均高表達HMGB1，且HMGB1表達陽性細胞數目顯著多于健康對照組[1，6-7]。HMGB1在啟動和維持炎癥瀑布式反應中具有核心作用，它可以誘導炎癥細胞分泌IL-1β、TNF-α，同時在其他細胞因子的參與下，IL-1β、TNF-α也可以促進炎癥細胞釋放HMGB1，二者呈相互調節，相互促進，形成一個以HMGB1和IL-1β、TNF-α為核心的炎癥激活正反饋環路，反復激活NF-κB途徑，調節其他炎癥因子和趨化因子的轉錄和表達，導致大量炎癥因子在氣道和肺泡及血管周圍聚集，參與COPD氣道特異性炎癥的形成。Hou等[8]及代靈靈等[2]在COPD患者的誘導痰中檢測到高表達的HMBG1，并發現HMGB1的表達量和病情嚴重程度密切相關，再次驗證了氣道內HMGB1表達與COPD氣道炎癥的內在聯系。肺泡襯液為貼覆在細支氣管和肺泡表面的一層液體，其內容物主要來源于支氣管肺泡上皮細胞、支氣管及肺泡巨噬細胞及中性粒細胞的主動分泌或被動釋放，能夠較真實和準確反映氣道和肺泡的炎癥狀態。本研究將支氣管肺泡灌洗液作為檢測對象，相較于血液和痰液，關聯性更好，但難點在于對照組的選擇。常規將健康體檢者作為對照組在本研究中難以實現，本研究將亞急性和慢性咳嗽(大于4周)的門診患者納入初篩組，經相關檢查排除肺炎、肺結核、腫瘤等可引起血清或氣道內HMGB1升高的疾病(設立嚴格排除條件)，診斷考慮為上氣道綜合征的患者納入對照組，行支氣管鏡檢查。現有的資料尚未發現這種上氣道疾病會導致血清或下氣道局部HMGB1水平升高。同時不明原因的慢性咳嗽有行支氣管鏡檢查的指征，不違背診療常規。

本研究結果顯示COPD組氣道內HMGB1和TNF-α、IL-1β的水平顯著高于對照組，且HMGB1的水平和TNF-α、IL-1β水平正相關，這也驗證了HMGB1和TNF-α、IL-1β在炎癥網絡中存在正反饋環路，其相互促進和激活的正向調節的關系，維持著氣道和肺泡內大量炎癥因子的聚集，放大炎癥效應[1,7]。TNF-α和IL-1β是氣道炎性反應中非常重要的早期炎癥因子，既往的干預研究著重于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8這些早期炎癥因子的阻斷，其抗炎效果短暫而有限。同時阻斷晚期炎癥介質HMGB1的炎癥通路，可能比單純阻斷早期炎癥因子更為有效和持久。這提示可以將HMGB1作為治療COPD新的靶點，相關的動物實驗也已開展[9]。

本研還發現，在COPD患者中，BALF中 HMGB1含量和肺功能FEV1%預計值呈負相關，提示氣道內HMGB1的含量和氣流受限的嚴重程度有一定的關系。這也符合既往的研究結果[10-11]。HMGB1在慢性氣道炎癥中的作用不僅在于啟動炎性反應，放大炎癥信號，還能促進小氣道纖維化導致氣道重塑，引起氣流受限和肺氣腫，機制目前尚不明確，可能在于：(1)HMGB1在組織修復中充當化學吸引劑的作用，吸引成纖維細胞、內皮細胞和平滑肌細胞。(2)通過轉化成長因子β(TGF-β)介導小氣道的纖維化和重塑。在COPD病理生理機制中，氣道纖維化和重塑對于疾病的防治和預后非常重要，其涉及多種多種炎癥細胞和結構細胞，分子機制復雜。HMGB1如何參與其中，發揮什么作用尚需進一步研究。

綜上所述，HMGB1作為晚期炎癥分子，廣泛地參與COPD病理生理的多個方面，如氣道炎癥、肺實質破壞、氣道纖維化及重塑等。其關鍵環節在于啟動、放大并維持氣道慢性炎癥狀態，而這個過程需要HMGB1和其他炎癥因子相互協調、促進，共同形成復雜的炎癥因子網絡來實現。HMGB1在COPD炎癥中的確切調控機制及以HMGB1為靶點的干預措施仍需進一步研究。

參考文獻

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Expression and significance of high mobility group box 1 protein in BALF of patient with COPD*

Zhang Junqiang，Mei Xiaodong

(Department of Respiration，Affiliated Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University,Hefei，Anhui 230000，China)

[Abstract]ObjectiveTo preliminarily investigate the effect of high mobility group box 1 (HMGB1) in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) by detecting the HMGB1 level in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) of the COPD patients and analyzing the relation between HMGB1 and airway limitation．MethodsThe research subjects were divided into the COPD group (stable COPD,20 cases) and control group[20 cases of upper airway cough syndrome(UACS)]．All subjects were performed the bronchoscopic examination as well as bronchoalveolar lavage.The total cell counting and percentage of neutrophilic granulocytes in BLAF were detected and compared between the two groups.The HMGB1，IL-1β and TNF-α levels in BLAF were detected by using ELISA and compared between the two groups．The relation between HMGB1 with IL-1β and TNF-α and the relation between HMGB1 with pulmonary function(FEV1% predicted value) in the COPD group was analyzed．ResultsThe total cell counting and percentage of neutrophilic granulocytes of BLAF in the COPD group were higher than those in the control group (P<0.01)．The levels of HMGB1，IL-1β，TNF-α of BALF in the COPD group were higher than those in the control group(P<0.01,P<0.05,P<0.01)．In the COPD group,the HMGB1 level in BALF was positively correlated with the IL-1β and TNF-α levels(r=0.79，P<0.01；r=0.48，P<0.05),while negatively related with the pulmonary function value(FEV1% predicted value,r=-0.70,P<0.01)．ConclusionHMGB1 participates in and promotes the occurrence and development of COPD airway inflammation and the HMGB1 level in BALF is correlated with the severity of COPD．

[Key words]chronic obstructive pulmonary disease;high mobility group box 1;airway inflammation

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.006

* 基金項目：2009年安徽省教育廳省級自然科學研究項目(KJ2009B025Z)。

作者簡介：章俊強(1980-)，博士在讀，主治醫師，主要從事氣道炎癥性疾病的研究。

[中圖分類號]R563

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)08-1026-03

(收稿日期：2015-09-16修回日期：2015-11-26)