慢性阻塞性肺疾病患者支氣管肺泡灌洗液中HMGB1的表達(dá)及意義*

章俊強(qiáng)，梅曉冬

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院呼吸科，合肥 230001)

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慢性阻塞性肺疾病患者支氣管肺泡灌洗液中HMGB1的表達(dá)及意義*

章俊強(qiáng)，梅曉冬

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院呼吸科，合肥 230001)

[摘要]目的通過(guò)測(cè)定慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的支氣管肺泡灌洗液(BALF)中高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的含量并分析HMGB1和氣流受限的關(guān)系，初步探討HMGB1在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用。方法將研究對(duì)象分為COPD組(COPD穩(wěn)定期20例)和對(duì)照組(上氣道咳嗽綜合征20例)，均行支氣管鏡檢查并行支氣管肺泡灌洗術(shù)，檢測(cè)并比較兩組BALF中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比；用ELISA法測(cè)定并比較兩組HMGB1、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量，分析COPD組HMGB1和IL-1β、TNF-α間的關(guān)系及HMGB1和肺功能(FEV1%預(yù)計(jì)值)的關(guān)系。結(jié)果在BALF中，COPD組細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比高于對(duì)照組(P<0.01)；COPD組HMGB1、IL-1β、TNF-α的含量高于對(duì)照組(P<0.01、P<0.05、P<0.01)，COPD組HMGB1的含量和IL-1β、TNF-α呈正相關(guān)(r=0.79,P<0.01及r=0.48，P<0.05)；COPD組HMGB1和肺功能值(吸入支氣管舒張劑后FEV1%預(yù)計(jì)值)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.70,P<0.01)。結(jié)論HMGB1參與和促進(jìn)COPD氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展，BALF中HMGB1水平和COPD嚴(yán)重程度相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]慢性阻塞性肺疾病；高遷移率族蛋白B1；氣道炎癥

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征性病理表現(xiàn)為氣道慢性炎癥，其氣道內(nèi)能檢測(cè)到大量炎癥細(xì)胞和炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1α、IL-1β、IL-6、IL-8等，這些早期炎癥介質(zhì)對(duì)于氣道炎癥的形成和維持具有重要作用。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是一種重要的晚期炎癥因子，在炎性反應(yīng)中分泌時(shí)間較晚，維持時(shí)間較長(zhǎng)。主動(dòng)分泌和被動(dòng)釋放的HMGB1在復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)中扮演重要角色，在膿毒血癥、急性肺損傷、休克及自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)病過(guò)程中多有涉及。HMGB1在COPD 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮什么作用，如何參與其中目前尚不明確，相關(guān)研究也比較少。2009年，Nassima等[1]在COPD患者外周氣道上皮組織中檢測(cè)到高表達(dá)的HMGB1，并闡述了HMGB1在COPD患者氣道炎癥形成及氣道重塑中發(fā)揮著重要作用。代靈靈等[2]在COPD患者誘導(dǎo)痰中的檢測(cè)到高表達(dá)的HMGB1，進(jìn)一步驗(yàn)證了HMGB1在COPD氣道炎癥中的作用。相比于血液和痰液等標(biāo)本，支氣管肺泡灌洗液(BALF)更接近肺泡襯液，其檢測(cè)更能體現(xiàn)COPD氣道及肺泡本身炎癥的特征。本研究通過(guò)檢測(cè)COPD患者支氣管肺泡灌洗液中HMGB1的水平，并分析其與典型早期炎癥因子IL-1β、TNF-α的關(guān)系，初步探討HMGB1在COPD特征性炎癥中的作用，并分析HMGB1的表達(dá)和氣流受限程度的關(guān)系，進(jìn)一步探索HMGB1的水平和疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1入選標(biāo)準(zhǔn)(1)COPD組：安徽省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科2010年9月至2012年12月因COPD就診的COPD穩(wěn)定期病例20例。COPD穩(wěn)定期指COPD患者咳嗽、咳痰、氣短等癥狀穩(wěn)定或癥狀較輕，其診斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)中國(guó)《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2007年修訂版)[3]。(2)對(duì)照組：因亞急性或慢性咳嗽癥狀至安徽省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科門(mén)診和住院部診治的患者20例，經(jīng)相應(yīng)檢查診斷為上氣道咳嗽綜合征。上氣道咳嗽綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中國(guó)《咳嗽診治與治療指南2009版》[4]。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn)合并有社區(qū)獲得性肺炎、院內(nèi)獲得性肺炎、間質(zhì)性肺炎、惡性腫瘤、全身嚴(yán)重感染者如敗血癥、膿毒癥、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等可引起血清HMGB1升高的疾病；有纖維支氣管鏡檢查禁忌證者如嚴(yán)重低氧血癥、呼吸困難、惡性心律失常、凝血功能異常等。

1.2檢測(cè)方法征得每個(gè)患者的同意，并簽訂知情同意書(shū)后給患者行電子支氣管鏡檢查及支氣管肺泡灌洗術(shù)，收集灌洗液。支氣管肺泡灌洗術(shù)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病分會(huì)2002年制定的支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)規(guī)范[5]。將灌洗液離心，留取上清液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中測(cè)定白細(xì)胞總數(shù)，并離心沉淀，用沉渣細(xì)胞制備細(xì)胞涂片，瑞氏染色行中性粒細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)BALF上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α的含量(ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司)，檢測(cè)方法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。COPD患者肺功能檢查前吸入沙丁胺醇?xì)忪F劑200 μg，15 min后用肺功能儀(德國(guó)圣迪斯)測(cè)定第1秒用力呼氣容積(FEV1)及FEV1占預(yù)計(jì)值的百分比(FEV1%預(yù)計(jì)值)。

2結(jié)果

2.1人口學(xué)特征兩組性別、年齡、吸煙狀況無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。

2.2BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比值及各細(xì)胞因子濃度COPD組BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞比值分別為(6.09±4.56)×109/L和0.44±0.15，高于對(duì)照組(1.13±0.94)×109/L和0.08±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；COPD組BALF中HMGB1的含量為(64.10±37.40)μg/L，顯著高于對(duì)照組[(7.79±4.46)μg/L，t=6.69，P<0.01]；COPD組BALF中IL-1β、TNF-α含量為(3.38±3.52)μg/L和(3.92±4.09)μg/L,高于對(duì)照組(1.44±1.83)μg/L和(1.18±1.53)μg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)，見(jiàn)圖1。

表1　COPD組及對(duì)照組人口學(xué)特征

圖1　BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比值及各細(xì)胞因子濃度

圖2　BALF中HMGB1含量和IL-1β、TNF-α及FEV1%預(yù)計(jì)值散點(diǎn)圖

2.3BALF中HMGB1含量和IL-1β、TNF-α及FEV1%預(yù)計(jì)值COPD組BALF中HMGB1的含量和IL-1β含量呈正相關(guān)(r=0.79，P<0.01)；和TNF-α呈正相關(guān)(r=0.48，P<0.05)；20例COPD患者吸入支氣管擴(kuò)張劑后肺功能檢查FEV1%預(yù)計(jì)值為0.56±0.01，與BALF中HMGB1的含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.70，P<0.01)，見(jiàn)圖2。

3討論

COPD是呼吸系統(tǒng)疾病中重要疾病，其發(fā)病機(jī)制不甚清楚，目前認(rèn)為COPD是一種以多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、多種炎癥介質(zhì)共同參與的氣道慢性炎癥。以IL-1β、TNF-α等為代表性的早期炎癥因子在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用已被廣泛研究和闡述，但對(duì)于晚期炎癥因子的代表HMGB1在COPD炎癥應(yīng)答中究竟起何作用目前研究甚少。有研究發(fā)現(xiàn)COPD支氣管肺組織中上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞均高表達(dá)HMGB1，且HMGB1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著多于健康對(duì)照組[1，6-7]。HMGB1在啟動(dòng)和維持炎癥瀑布式反應(yīng)中具有核心作用，它可以誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α，同時(shí)在其他細(xì)胞因子的參與下，IL-1β、TNF-α也可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞釋放HMGB1，二者呈相互調(diào)節(jié)，相互促進(jìn)，形成一個(gè)以HMGB1和IL-1β、TNF-α為核心的炎癥激活正反饋環(huán)路，反復(fù)激活NF-κB途徑，調(diào)節(jié)其他炎癥因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致大量炎癥因子在氣道和肺泡及血管周?chē)奂瑓⑴cCOPD氣道特異性炎癥的形成。Hou等[8]及代靈靈等[2]在COPD患者的誘導(dǎo)痰中檢測(cè)到高表達(dá)的HMBG1，并發(fā)現(xiàn)HMGB1的表達(dá)量和病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，再次驗(yàn)證了氣道內(nèi)HMGB1表達(dá)與COPD氣道炎癥的內(nèi)在聯(lián)系。肺泡襯液為貼覆在細(xì)支氣管和肺泡表面的一層液體，其內(nèi)容物主要來(lái)源于支氣管肺泡上皮細(xì)胞、支氣管及肺泡巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的主動(dòng)分泌或被動(dòng)釋放，能夠較真實(shí)和準(zhǔn)確反映氣道和肺泡的炎癥狀態(tài)。本研究將支氣管肺泡灌洗液作為檢測(cè)對(duì)象，相較于血液和痰液，關(guān)聯(lián)性更好，但難點(diǎn)在于對(duì)照組的選擇。常規(guī)將健康體檢者作為對(duì)照組在本研究中難以實(shí)現(xiàn)，本研究將亞急性和慢性咳嗽(大于4周)的門(mén)診患者納入初篩組，經(jīng)相關(guān)檢查排除肺炎、肺結(jié)核、腫瘤等可引起血清或氣道內(nèi)HMGB1升高的疾病(設(shè)立嚴(yán)格排除條件)，診斷考慮為上氣道綜合征的患者納入對(duì)照組，行支氣管鏡檢查。現(xiàn)有的資料尚未發(fā)現(xiàn)這種上氣道疾病會(huì)導(dǎo)致血清或下氣道局部HMGB1水平升高。同時(shí)不明原因的慢性咳嗽有行支氣管鏡檢查的指征，不違背診療常規(guī)。

本研究結(jié)果顯示COPD組氣道內(nèi)HMGB1和TNF-α、IL-1β的水平顯著高于對(duì)照組，且HMGB1的水平和TNF-α、IL-1β水平正相關(guān)，這也驗(yàn)證了HMGB1和TNF-α、IL-1β在炎癥網(wǎng)絡(luò)中存在正反饋環(huán)路，其相互促進(jìn)和激活的正向調(diào)節(jié)的關(guān)系，維持著氣道和肺泡內(nèi)大量炎癥因子的聚集，放大炎癥效應(yīng)[1,7]。TNF-α和IL-1β是氣道炎性反應(yīng)中非常重要的早期炎癥因子，既往的干預(yù)研究著重于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8這些早期炎癥因子的阻斷，其抗炎效果短暫而有限。同時(shí)阻斷晚期炎癥介質(zhì)HMGB1的炎癥通路，可能比單純阻斷早期炎癥因子更為有效和持久。這提示可以將HMGB1作為治療COPD新的靶點(diǎn)，相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也已開(kāi)展[9]。

本研還發(fā)現(xiàn)，在COPD患者中，BALF中 HMGB1含量和肺功能FEV1%預(yù)計(jì)值呈負(fù)相關(guān)，提示氣道內(nèi)HMGB1的含量和氣流受限的嚴(yán)重程度有一定的關(guān)系。這也符合既往的研究結(jié)果[10-11]。HMGB1在慢性氣道炎癥中的作用不僅在于啟動(dòng)炎性反應(yīng)，放大炎癥信號(hào)，還能促進(jìn)小氣道纖維化導(dǎo)致氣道重塑，引起氣流受限和肺氣腫，機(jī)制目前尚不明確，可能在于：(1)HMGB1在組織修復(fù)中充當(dāng)化學(xué)吸引劑的作用，吸引成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。(2)通過(guò)轉(zhuǎn)化成長(zhǎng)因子β(TGF-β)介導(dǎo)小氣道的纖維化和重塑。在COPD病理生理機(jī)制中，氣道纖維化和重塑對(duì)于疾病的防治和預(yù)后非常重要，其涉及多種多種炎癥細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞，分子機(jī)制復(fù)雜。HMGB1如何參與其中，發(fā)揮什么作用尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，HMGB1作為晚期炎癥分子，廣泛地參與COPD病理生理的多個(gè)方面，如氣道炎癥、肺實(shí)質(zhì)破壞、氣道纖維化及重塑等。其關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于啟動(dòng)、放大并維持氣道慢性炎癥狀態(tài)，而這個(gè)過(guò)程需要HMGB1和其他炎癥因子相互協(xié)調(diào)、促進(jìn)，共同形成復(fù)雜的炎癥因子網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)。HMGB1在COPD炎癥中的確切調(diào)控機(jī)制及以HMGB1為靶點(diǎn)的干預(yù)措施仍需進(jìn)一步研究。

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Expression and significance of high mobility group box 1 protein in BALF of patient with COPD*

Zhang Junqiang，Mei Xiaodong

(Department of Respiration，Affiliated Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University,Hefei，Anhui 230000，China)

[Abstract]ObjectiveTo preliminarily investigate the effect of high mobility group box 1 (HMGB1) in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) by detecting the HMGB1 level in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) of the COPD patients and analyzing the relation between HMGB1 and airway limitation．MethodsThe research subjects were divided into the COPD group (stable COPD,20 cases) and control group[20 cases of upper airway cough syndrome(UACS)]．All subjects were performed the bronchoscopic examination as well as bronchoalveolar lavage.The total cell counting and percentage of neutrophilic granulocytes in BLAF were detected and compared between the two groups.The HMGB1，IL-1β and TNF-α levels in BLAF were detected by using ELISA and compared between the two groups．The relation between HMGB1 with IL-1β and TNF-α and the relation between HMGB1 with pulmonary function(FEV1% predicted value) in the COPD group was analyzed．ResultsThe total cell counting and percentage of neutrophilic granulocytes of BLAF in the COPD group were higher than those in the control group (P<0.01)．The levels of HMGB1，IL-1β，TNF-α of BALF in the COPD group were higher than those in the control group(P<0.01,P<0.05,P<0.01)．In the COPD group,the HMGB1 level in BALF was positively correlated with the IL-1β and TNF-α levels(r=0.79，P<0.01；r=0.48，P<0.05),while negatively related with the pulmonary function value(FEV1% predicted value,r=-0.70,P<0.01)．ConclusionHMGB1 participates in and promotes the occurrence and development of COPD airway inflammation and the HMGB1 level in BALF is correlated with the severity of COPD．

[Key words]chronic obstructive pulmonary disease;high mobility group box 1;airway inflammation

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.006

* 基金項(xiàng)目：2009年安徽省教育廳省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2009B025Z)。

作者簡(jiǎn)介：章俊強(qiáng)(1980-)，博士在讀，主治醫(yī)師，主要從事氣道炎癥性疾病的研究。

[中圖分類(lèi)號(hào)]R563

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)08-1026-03

(收稿日期：2015-09-16修回日期：2015-11-26)