菊粉對小鼠的免疫調節(jié)作用

宮 強，阮夢蝶，馬麗蘋，牛明福，任國艷，侯 穎，秦翠麗，孫曉菲，李 陽

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南省食品原料工程技術研究中心，河南 洛陽 471023）

菊粉對小鼠的免疫調節(jié)作用

宮 強，阮夢蝶，馬麗蘋，牛明福，任國艷，侯 穎，秦翠麗，孫曉菲，李 陽

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南省食品原料工程技術研究中心，河南 洛陽 471023）

為探討菊粉對小鼠的免疫調節(jié)作用，本實驗以200、400、600 mg/kg的劑量對雌性BALB/c小鼠進行灌胃，每天1 次，連續(xù)15 d。通過對小鼠免疫功能的測定評價不同劑量菊粉的免疫調節(jié)作用。結果顯示，各劑量的菊粉灌胃組小鼠各項免疫指標均高于對照組。其中，中、高劑量組小鼠的免疫器官指數、腹腔巨噬細胞吞噬能力、血清溶血素水平、脾淋巴細胞增殖水平和γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）分泌水平顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）高于對照組。以上研究結果表明，菊粉對小鼠具有較好的免疫增強作用。

菊粉；小鼠；免疫調節(jié)

多糖又稱為多聚糖，是由10 個以上單糖殘基以糖苷鍵相連而形成的聚合糖高分子碳水化合物，包括微生物多糖、植物多糖和動物多糖等，是生物細胞的重要組成部分，在維持細胞的正常結構、控制細胞分裂分化、調節(jié)細胞生長衰老以及能量儲存等方面具有重要的生物學功能［1］。目前生物多糖的應用已涉及人類生活的各個領域，如微生物多糖作為增稠劑、乳化劑、食品添加劑等被廣泛應用于石油、化工、食品等多種工業(yè)領域。此外，有些生物多糖也已作為免疫增強劑應用于醫(yī)藥領域［2］。自20世紀30年代Shear發(fā)現生物多糖具有抗腫瘤活性之后，人們對多糖免疫調節(jié)活性的研究日益深入［3］。尤其是近30 a來，隨著分子生物學技術的迅猛發(fā)展，人們對多糖的生物學功能有了全新的認識，從而極大地促進了糖生物學的發(fā)展。現有的研究表明多種生物多糖具有廣譜的免疫調節(jié)作用，如提高巨噬細胞的吞噬能力、促進T、B淋巴細胞的增殖、激活補體系統(tǒng)等［4］。

菊粉是存在于菊芋、菊苣等多種菊科植物中的一種天然多糖，其主要成分是一類結構相似的果聚糖，與低聚糖結構上的根本區(qū)別在于聚合度上的差異，因而可將低聚果糖認為是菊粉的一種［5］，而低聚果糖則具有促進雙歧桿菌增殖、誘導腸黏膜淋巴系統(tǒng)的免疫活性、激活體液和細胞免疫應答等多種功能［6］。魏軼男［7］的研究表明，菊粉添加于肉仔雞飼料中可有效提高其免疫器官指數并具有一定的抗氧化能力。Gourbeyre等［8］將低聚半乳糖/菊粉益生元添加于飲食中喂養(yǎng)小鼠，結果可增強實驗動物的免疫功能及腸道屏障功能。上述研究是將菊粉作為飼料或食品添加劑來探討菊粉對動物機體免疫功能的促進作用，而單獨服用菊粉是否也具有此作用？本實驗對此進行一定的研究，以期為菊粉保健食品的開發(fā)提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞及試劑

雌性BALB/c小鼠購自河南科技大學實驗動物中心；雞紅細胞和綿羊紅細胞（sheep red blood cell，SRBC）購自鄭州百基生物工程有限公司。豚鼠補體由河南科技大學食品與生物工程學院、河南省食品原料工程技術研究中心制備：分別采取5 只豚鼠新鮮血液，分離血清，充分混合均勻后，取5 mL血清加入1 mL壓積SRBC，置于4 ℃冰箱內吸附30 min后離心取上清液，置于－20 ℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

菊粉、四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）及γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）檢測試劑盒美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及飼喂

體質量為18～20 g的雌性BALB/c小鼠共100 只，隨機平均分為4 組，分別為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。菊粉按照實驗所需劑量配制成相應濃度，參照文獻［9］的劑量給藥，低、中和高劑量組小鼠分別按照菊粉200、400、600 mg/kg（以體質量計）的劑量進行灌胃，每日1 次，連續(xù)15 d，期間對照組小鼠正常狀態(tài)下飼喂。

1.2.2 小鼠免疫器官指數的測定

灌胃15 d后，每組隨機取5 只小鼠，稱取其體質量，隨后脫頸處死小鼠，無菌條件下摘取胸腺和脾臟，去除脂肪后稱質量，計算各組小鼠的胸腺和脾臟指數，計算公式如下。

1.2.3 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的測定

采用小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的方法進行測定［10］。末次灌胃2 h后，每組隨機取5 只小鼠，向小鼠腹腔注射0.5 mL體積分數為10%的雞紅細胞懸液，6 h后脫頸，處死小鼠。再向小鼠腹腔注射2 mL生理鹽水，輕揉腹部邊緣5 min，以無菌注射器吸取腹腔液，滴于潔凈的載玻片上，于37 ℃濕盒內放置30 min。隨后以生理鹽水漂洗，自然干燥后以丙酮-甲醇（體積比1∶1）固定，以體積分數為4%的Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min，無菌水漂洗后自然干燥，油鏡下觀察，計算小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬百分比和吞噬指數，計算公式如下［11-12］。

1.2.4 血清溶血素的檢測

采用半數溶血值法測定各組小鼠的血清溶血素含量。各組小鼠在灌胃15 d后，各取5 只給予腹腔注射0.2 mL 2%的SRBC懸液。正常飼喂5 d后眼眶采血，分離血清，以無菌生理鹽水稀釋200 倍。取干凈試管，向其中依次加入稀釋后的血清1 mL，10%的SRBC 0.5 mL和補體（稀釋10 倍的生理鹽水）1 mL，混合均勻，同時設立無血清的空白對照管，于37 ℃水浴中放置30 min后以冰水浴終止反應。離心取上清1 mL與3 mL都氏試劑混合均勻，同時取10%的SRBC懸液0.25 mL加都氏試劑至4 mL充分混勻作為半數溶血管。放置10 min后，以對照管為空白，測定各樣品管在540 nm波長處的光密度（OD）值，以半數溶血值（half value of hemolysin，HC50）表示各組小鼠血清溶血素的含量，計算公式如下。

1.2.5 脾淋巴細胞增殖實驗

末次灌胃2 d后，每組取小鼠5 只脫頸處死，無菌采取脾臟制備脾細胞懸液，調整細胞濃度為1h107個/mL。96 孔細胞培養(yǎng)板每孔加入脾細胞懸液50 μL，同時設陰性對照。實驗孔和陰性對照孔各設3 個重復，實驗孔每孔加入50 μL 10 μg/mL的ConA，陰性對照孔每孔加入50 μL RPIM1640培養(yǎng)液，置于37 ℃，體積分數為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，繼續(xù)培3 h。然后每孔加100 μL十二烷基硫酸鈉-鹽酸鹽（sodium dodecyl sulfate- hydrochloric acid，SDS-HCl），繼續(xù)作用2 h終止反應，測定570 nm波長處光密度值，計算刺激值（stimulation index，SI），計算公式如下。

1.2.6 IFN-γ分泌實驗

末次灌胃2 d后，每組取5 只小鼠處死，無菌條件下迅速取出脾臟制備脾淋巴細胞懸液，細胞計數后調整細胞濃度為1h107個/mL。按上述同樣方法制備ConA活化的脾淋巴細胞，于37 ℃ 體積分數為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，吸取培養(yǎng)上清液，離心收集后于－20 ℃保存。按照IFN-γ檢測試劑盒制作標準曲線，對免疫小鼠脾細胞分泌的IFN-γ進行檢測。

2 結果與分析

2.1 菊粉對免疫器官指數的影響

對各組小鼠灌胃結束后摘取胸腺和脾臟，測定其免疫器官指數。由表1可知，以菊粉灌胃15 d后，低、中、高劑量組小鼠的胸腺指數和脾臟指數均較對照組有所升高，其中，中劑量組與高劑量組小鼠的免疫器官指數與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），表明菊粉可顯著促進小鼠免疫器官的發(fā)育。

表1 菊粉對小鼠免疫器官指數的影響Table 1 Effect of inulin on immune organ indices of mice

2.2 菊粉對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響

以吞噬雞紅細胞法測定各組小鼠巨噬細胞吞噬能力。由表2可知，菊粉具有增強小鼠巨噬細胞吞噬紅細胞的能力，且隨灌胃劑量的增加而增強。其中，中、高劑量組小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬率與對照組相比差異顯著（P＜0.05），其吞噬指數與對照相比差異極顯著（P＜0.01）。

表2 菊粉對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響Table 2 Effect of inulin on phagocytic capacity of peritoneal macrophages in mice

2.3 小鼠血清溶血素檢測結果

以半數溶血值法測定不同劑量菊粉灌胃后小鼠血清溶血素的生成情況。由表3可知，低劑量組小鼠半數溶血值高于對照組，但兩者在統(tǒng)計學上無明顯差異；中、高劑量組與對照組相比，其差異分別為顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01），表明隨菊粉劑量的升高，其抗體生成能力有所增強。

表3 小鼠血清溶血素測定結果Table 3 Contents of serum hemolysin in mice

2.4 淋巴細胞增殖實驗結果

末次灌胃2 d后，制備各組小鼠的脾淋巴細胞懸液，MTT法檢測其增殖情況。由圖1可知，菊粉灌胃組小鼠的脾淋巴細胞增殖水平均高于對照組，且隨劑量的增加而升高，中劑量組與對照組相比其SI值差異顯著（P＜0.05），而高劑量組則與對照組表現出極顯著的差異（P＜0.01）。

圖1 小鼠淋巴細胞增殖情況Fig.1 Proliferation of lymphocytes from mice administered with inulin

2.5 IFN-γ分泌水平

末次灌胃2 d后，同樣制備脾淋巴細胞懸液，以ConA進行誘生，收集上清，檢測上清中IFN-γ的含量。由圖2可知，經ConA誘生后，低劑量組小鼠脾淋巴細胞分泌的IFN-γ水平略高于對照組，兩者無統(tǒng)計學差異，中、高劑量組分泌的IFN-γ水平則明顯高于對照組（P＜0.01）。

圖2 小鼠脾淋巴細胞IFN-γ分泌水平Fig.2 Levels of IFN-γ secreted by splenic lymphocytes in mice

3 討 論

近年來，隨著人們對各種生物多糖保健功能的深入了解，對其在免疫調節(jié)方面的探索已成為免疫學領域研究的熱點之一。國內外研究表明多種生物多糖均具有一定的免疫調節(jié)作用［13-19］，菊粉即是其中之一。已有的研究表明，將菊粉作為飼料添加劑可促進畜禽的生長并可提高其血清免疫球蛋白的含量［20-22］。另外，菊粉也可作為疫苗佐劑以增強疫苗的免疫效果，如Saade等［23］實驗表明菊粉作為疫苗佐劑可增強乙肝疫苗誘導機體產生的體液和細胞免疫應答水平。Honda-Okubo等［24］研究了菊粉對H1N1流感病毒滅活疫苗的佐劑效應，結果表明菊粉可提高流感疫苗的免疫效果。此外，菊粉作為疫苗佐劑在日本乙型腦炎疫苗、HIV疫苗、H5N1流感病毒疫苗等中的研究都有相關報道［25-27］。

胸腺和脾臟是動物機體主要的免疫器官，胸腺是T淋巴細胞分化成熟的場所，脾臟則是機體最大的免疫器官。因此，胸腺和脾臟指數可在一定程度上反映機體對抗原的免疫應答水平，本實驗結果顯示菊粉的攝入可提高小鼠的脾臟和胸腺指數，表明其具有增強小鼠免疫功能的作用。

巨噬細胞可通過吞噬作用殺滅和清除病原體及異物，在機體對抗原的非特異性免疫應答中發(fā)揮著重要作用，本研究通過巨噬細胞吞噬實驗證實菊粉可有效增強小鼠巨噬細胞的吞噬能力，表明菊粉對小鼠非特異性免疫反應具有一定的促進作用。

機體的特異性免疫反應包括體液免疫應答和細胞免疫應答，血清溶血素實驗是測定體液免疫應答水平的方法之一，本實驗對各組小鼠灌胃后的血清溶血素水平進行了檢測，結果表明，隨劑量的升高，菊粉灌胃組小鼠的血清溶血素水平明顯高于對照組，說明菊粉具有增強小鼠抗體應答的能力。在細胞免疫反應中，淋巴細胞增殖實驗是檢測細胞免疫功能指標的常用方法［28-29］，常通過淋巴細胞對ConA刺激后的轉化程度來衡量T淋巴細胞的應答功能。同時，T細胞分泌的多種細胞因子如IFN-γ、IL-2等在細胞免疫應答中也具有重要作用，本實驗對各組小鼠脾淋巴細胞的增殖水平及其分泌的IFN-γ水平進行了檢測。檢測結果與血清溶血素實驗一致，菊粉灌服組小鼠的脾淋巴細胞增殖水平及其分泌的IFN-γ水平均明顯高于對照組，表明菊粉同樣具有增強小鼠細胞免疫應答的能力。

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Effect of Inulin on Modulating Immune Function in Mice

GONG Qiang， RUAN Mengdie， MA Liping， NIU Mingfu， REN Guoyan， HOU Ying， QIN Cuili， SUN Xiaofei， LI Yang
（Henan Engineering Research Center of Food Material， College of Food and Bioengineering， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023， China）

To explore the effect of inulin on immune modulation in mice， 100 BALB/c female mice were allocated to control group， low-dose inulin group， mid-dose inulin group and high-dose inulin group， respectively. Then， the mice in three inulin groups were orally administered with inulin at doses of 200， 400 and 600 mg/（kg·d） body weight， respectively. After 15 days of consecutive administration， immune function indexes in these mice were detected. The results showed that inulin at both mid and high doses could significantly enhance immune organ indexes， phagocytotic capacity of peritoneal macrophages， the level of serum hemolysin， lymphocyte proliferation （SI value） and the level of interferon-γ （IFN-γ） (P ＜ 0.05） or （P ＜ 0.01），indicating that inulin improves immune function in mice to some degree.

inulin； mice； immune modulation

10.7506/spkx1002-6630-201607037

O629.12

A

1002-6630（2016）07-0204-04

宮強， 阮夢蝶， 馬麗蘋， 等. 菊粉對小鼠的免疫調節(jié)作用［J］. 食品科學， 2016， 37（7）： 204-207. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607037. http：//www.spkx.net.cn

GONG Qiang， RUAN Mengdie， MA Liping， et al. Effect of inulin on modulating immune function in mice［J］. Food Science，2016， 37（7）： 204-207. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607037. http：//www.spkx.net.cn

2015-06-01

宮強（1979—），男，副教授，博士，研究方向為分子生物學與免疫學。E-mail：gongqiang79@126.com