塞來昔布抑制非小細胞肺癌腫瘤增殖及血管生成效果的實驗研究

張俊玲+王培毅+續飛+魏燕+任濱+王軍

[摘要]目的探討塞來昔布抑制非小細胞肺癌腫瘤增殖及血管生成的效果。方法48只裸鼠建立非小細胞肺癌模型后，分為兩組，均使用含有塞來昔布的飼料喂養，觀察組則聯合使用濃度為100μmol/L的塞來昔布治療，持續120d后，比較兩組細胞增殖情況及血管內皮生長因子水平和微血管密度。結果觀察組72h抑瘤率高于對照組（P<0.05），細胞凋亡染色率（TUNEL法）高于對照組（P<0.05），血管內皮生長因子整體水平低于對照組（P<0.05），微血管密度低于對照組。結論對非小細胞肺癌大鼠，使用100μmol/L塞來昔布治療能較好的抑制肺癌腫瘤細胞的增殖以及新生血管的形成，且隨著時間的延長，抑瘤率提高。

[關鍵詞]塞來昔布；非小細胞肺癌；腫瘤增殖；血管生成；實驗研究

以往研究已經證實，COX-2的表達與多種實體惡性腫瘤存在相關性，針對非小細胞肺癌患者，其同樣呈現陽性表達，而且COX-2的高表達性，預示著腫瘤細胞具有較強的侵襲性以及早期的淋巴轉移傾向。其機制包括：促使腫瘤細胞的增殖抑制凋亡、促進腫瘤組織新生血管的形成同時抑制機體免疫反應等。目前多數學者認為非甾體抗炎藥物可在體內及體外均起到抑制人非小細胞肺癌的增殖的作用，尤其是塞來昔布治療后，一般于4周左右，肺癌腫塊出現明顯縮小，其發生轉移時間延長，幾率降低。鑒于目前對于使用非甾體抗炎藥物輔助治療非小細胞肺癌尚無推薦劑量。本研究主要通過比較新型非甾體抗炎藥物一塞來昔布對腫瘤細胞增殖及對血管生成的影響，探討其治療非小細胞肺癌的臨床效果，現報道如下。

1資料與方法

1.1材料及試劑來源

所選人肺腺癌A549細胞株購置于上海微生物細胞研究所。所選塞來昔布由安徽合肥森瑞化工有限責任公司生產，Annexin V-FITC凋亡試劑盒由美國PharMingen公司提供，噻唑藍試劑由華美生物材料公司生產，DMEM培養基由美國GIBCO公司提供，細胞原位凋亡檢測試劑盒由美國瑞馳生物公司提供。二氧化碳孵育箱由美國NAPCOInternational Corporatio提供，倒置型電子顯微鏡由日本奧利巴斯公司提供，Epicsrxl型四色流式細胞儀由美國貝克曼庫爾特公司提供，Mr5000型全自動酶標儀由美國Dynatech公司提供。

1.2細胞培養及建模

細胞培養首先將人肺腺癌A549細胞置于13%滅活小牛血清DMEM培養基內，于37℃5%二氧化碳及40%濕度條件恒溫箱內，保持培養基內青霉素和鏈霉素濃度控制在100U/mL。裸鼠建模：將含有2×10⁶細胞數的細胞懸液200μL分別注入6周齡裸鼠右前肢腋下，并將人組48只裸鼠進行隨機分為兩組，每組各24只，并于接種腫瘤細胞后第2天開始服用藥物，均使用含有塞來昔布1250mg/kg的飼料喂養，連續喂養120d，喂養期間對裸鼠精神食欲及排便情況進行觀察并記錄，每周對裸鼠體重及腫瘤大小進行監測。腫瘤體積計算（單位：mm3）=短徑²x長徑/2，120d后使用空氣注射法處死裸鼠，對腫瘤結節稱重并測量其體積。

1.3塞來昔布對A549細胞增殖作用的影響

觀察組將對數生長期人肺腺癌A549細胞5x10³個/孔接種至96孔培養板內，分別于24h及72h后，觀察組塞來昔布濃度為100μmol/L，加入助溶劑DMSO 5mL，對照組使用相同劑量的生理鹽水，培養液含有助溶劑DMSO 5mL，37℃40%濕度條件恒溫箱內培養4h，去除培養液后加入150μL助溶劑。使用全自動酶標檢測儀測定A 549nm值，計算兩組細胞生長抑制率（對照組A 549nm-觀察組A549nm）/對照組A 549nm]x100%。通過腫瘤結節重量計算抑瘤率：[1-（觀察組腫瘤結節質量/對照組腫瘤結節質量）1x100%。采用TUNEL法測定腫瘤細胞凋亡情況，并使用400倍高倍鏡觀察。

1.4兩組血管內皮生長因子水平及微血管密度檢測

均采用免疫組化實驗SP法進行，通過石蠟包埋并制備成厚4μm石蠟切片。分別進行常規HE染色和光鏡檢查，以及脫蠟與水化處理，血管內皮生長因子中免疫組化陽性為棕黃色，測定并計算平均吸光度。微血管密度計數采用Tanaka法進行，將腫瘤區內染成棕黃色單個內皮細胞或內皮細胞簇視為1個血管計數，由低倍鏡下確定5個高血管密度區，并確定為1個“熱點”，于高倍鏡下計算被染成黃色微血管平均數。

1.5統計學處理

應用SPSS13.0進行統計學處理，計量資料以（x±s）表示，兩組間均數的比較使用t檢驗，組間率的比較采用x²檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組24h及72h抑瘤率比較

對照組24h抑瘤率為（7.20±2.58）%，72h抑瘤率為（11.35±3.74）%，觀察組24h抑瘤率為（34.15±12.41）%，72h抑瘤率為（65.31±15.38）%，觀察組24h及72h抑瘤率顯著高于對照組（P<0.05）。見圖1。

2.2兩組細胞生長抑制率比較

觀察組細胞生長抑制率為（931±4.85）%，對照組細胞生長抑制率為（2.59±1.18）%，觀察組細胞生長抑制率高于對照組（P<0.05）。見圖2，表1。

2.3兩組微血管密度比較

觀察組微血管密度為（17.5±5.6）個/m㎡，對照組為（36.6±13.9）個/m㎡，觀察組細胞生長抑制率低于對照組（P<0.05）。見圖3，表1。

3討論

環氧化酶主要是催化前列腺素類因子生成的限速酶，其包括COX-1與COX-2兩種形式。大量研究提示，COX-2的過度表達是惡性腫瘤發生發展的相關因素。對肺癌患者的檢測發現，非小細胞肺癌的腺癌患者中的COX-2表達最為強烈，而小細胞肺癌患者則幾乎未見COX-2的過度表達。提示在非小細胞肺癌，尤其是腺癌患者使用COX-2抑制劑，可能取得較好的臨床效果。

本研究結果提示，觀察組24h抑瘤率為（34.15±12.41）%，72h抑瘤率為（65.31±15.38）%，觀察組24h及72h抑瘤率顯著高于對照組，見圖1。可能是因為使用含有塞來昔布飼料喂養的結果，但其效果遠不及觀察組，分別于37℃培養基下培養24h和72h，發生兩組在24h的抑瘤率低于72h，且有效濃度者抑瘤率高于低濃度者。故可以認為，塞來昔布對肺癌細胞增殖抑制效果，在藥物安全范圍內，隨著藥物濃度增高而增強。在使用有效濃度的塞來昔布治療后，達到了抑制肺癌細胞增值的有效濃度，促使肺癌細胞阻滯在C0/G1期，通過TUNEL法檢測后發現觀察組細胞生長抑制率為（9.31±4.85）%，對照組細胞生長抑制率為（2.59±1.18）%，見圖2。提示觀察組其TUNEL法細胞凋亡染色率顯著高于對照組。出現以上結果可能的原因是，有效濃度塞來昔布治療將肺癌細胞增值阻滯于細胞周期的GO/G1期，同時更好的誘導腫瘤細胞凋亡。同時針對兩組微血管密度比較發現，觀察組微血管密度為（17.5±5.6）個/m㎡，對照組為（36.6±13.9）個/m㎡，觀察組細胞生長抑制率低于對照組，見圖3。可考慮與塞來昔布對肺癌細胞的抑制效果呈時間相關性有關，藥物使用時間越長，其抑瘤率提高。其原因可能是，塞來昔布使用后將影響腫瘤細胞生長周期，延緩肺癌細胞的快速增殖，促使其凋亡。而且使用塞來昔布后，有效的抑制了COX-2的過度表達，從而抑制了肺癌細胞的增殖，促使肺癌細胞凋亡。且COX-2的抑制后，體內基質金屬蛋白酶表達水平降低，腫瘤細胞的細胞外基質被降解，腫瘤相關的血管生長因子表達顯著降低從而引起促進肺癌組織血管形成、侵襲與轉移的活性降低，故使用塞來昔布后其微血管密度顯著降低。

綜上所述，對非小細胞肺癌大鼠，使用100μmol/L的塞來昔布治療，能較好的抑制肺癌腫瘤細胞的增殖以及新生血管的形成，且隨著時間的延長，能更好的提高其抑瘤率。