香煙煙霧對COPD患者支氣管肺泡灌洗液SP—D的影響及激素的干預作用研究

李小波 周杰森 黃華瓊 毛立群

[摘要] 目的 研究COPD患者以及吸煙者BALF中SP-D的表達。研究香煙煙霧對Ⅱ型肺泡上皮細胞SP-D表達的影響以及激素對SP-D表達的調節。 方法 （1）實驗分為COPD組和對照組，根據是否有嗜煙史又將兩組各分為嗜煙組和不嗜煙組。各組患者行支氣管鏡檢查并行支氣管肺泡灌洗，檢測各組BALF中SP-D的表達。（2）培養人類Ⅱ型肺泡上皮細胞系，分為對照組和香煙煙霧提取物組，對照組：細胞在無血清的培養液中培養。香煙煙霧提取物組：在培養液中加入香煙煙霧提取物培養。12 h 后檢測SP-D的表達，然后予地塞米松加入培養液中干預，72 h 后檢測培養液中SP-D的水平。 結果 COPD組患者BALF中SP-D較對照組表達明顯降低。COPD組中嗜煙組BALF中SP-D明顯低于不嗜煙組。對照組中嗜煙組BALF中SP-D明顯低于不嗜煙組。體外實驗表明，香煙煙霧提取物干預組細胞培養液中SP-D的表達較對照組明顯降低，而經地塞米松處理后香煙煙霧提取物干預組細胞培養液中SP-D表達明顯增加，對照組經地塞米松處理前后SP-D表達沒有明顯變化。 結論 COPD患者BALF中SP-D的表達明顯降低。嗜煙可明顯下調BALF中SP-D的表達。香煙煙霧提取物干預的Ⅱ型肺泡上皮細胞培養液中SP-D的表達明顯降低，激素對Ⅱ型肺泡上皮細胞SP-D的表達具有上調作用。

[關鍵詞] 肺表面活性物質D；慢性阻塞性肺疾病；香煙煙霧；糖皮質激素；支氣管肺泡灌洗液

[中圖分類號] R562.1+2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）08-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of SP-D in BALF in COPD patients and smokers， and to study the effects of cigarette smoke on the expression of SP-D in type II alveolar epithelial cells and the regulation of SP-D by hormone. Methods （1）The experiment was divided into COPD group and control group， and according to whether there was a history of smoking addiction， they were further divided into smoking addiction group and non-smoking addiction group. Bronchoscopy and bronchoalveolar lavage were performed in all groups. The expression of SP-D in BALF was detected.（2）Human type II alveolar epithelial cell line was cultured， and they were divided into control group and cigarette smoke extract group. Control group： Cells were cultured in serum-free medium. Cigarette smoke extract group： Cigarette smoke extract was added to the culture medium. After 12 hours， the expression of SP-D was detected， and then dexamethasone was added into the culture medium. After 72 hours， the SP-D level in the culture medium was detected. Results The expression of SP-D in BALF in COPD patients was significantly lower than that in the control group. In the COPD group， SP-D in BALF in the smoking addiction group was significantly lower than that in the non-smoking addiction group. In the control group， SP-D in BALF was significantly lower than that in non-smoking addiction group. In vitro experiments showed that the expression of SP-D in the cell culture medium in the cigarette smoke extract intervention group was significantly lower than that in the control group. The expression of SP-D treated with dexamethasone in the cell culture medium in the cigarette smoke extract intervention group was significantly increased. There was no significant change of SP-D expression in the control group before and after dexamethasone treatment. Conclusion The expression of SP-D in BALF was significantly lower in COPD patients. Smoking addiction could down-regulate the expression of SP-D in BALF. The expression of SP-D in type Ⅱ alveolar epithelial cell culture medium treated with cigarette smoke extract is significantly decreased， and hormone up-regulates SP-D expression in type Ⅱ alveolar epithelial cells.

[Key words] Surfactant protein D； Chronic obstructive pulmonary disease（COPD）； Cigarette smoke； Glucocorticoid；Bronchoalveolar lavage fluid

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的肺部慢性疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性發展，與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關，它是呼吸系統的常見病和多發病，現階段我國約有2500萬COPD患者，每年約有100萬人死于COPD[1]。因此，鑒于COPD的高發病率，研究影響該疾病發生發展的干預因素，將具有重大的經濟效益和社會效益。肺表面活性物質替代治療在新生兒呼吸窘迫綜合征方面已經取得了令人滿意的臨床效果。近期研究發現，肺表面活性物質D（surfactant protein D，SP-D）在維持小氣道穩定、減低氣道阻力方面亦起重要作用，并可從多方面參與氣道免疫反應的調節[2]。本研究通過研究嗜煙以及不嗜煙的COPD患者和正常人支氣管肺泡灌洗液（bronchi alveolar lavage fluid，BALF）中SP-D的表達，研究香煙煙霧提取物對人類Ⅱ型肺泡上皮細胞分泌SP-D的影響以及激素對SP-D表達的調節作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選擇2014年6月～2016年6月我院呼吸內科住院及門診受試患者。COPD組：（1）入組標準：①符合COPD診斷標準；②性別不限；③年齡45～65歲；（2）排除標準：①惡性腫瘤患者；②自身免疫疾病患者；③糖尿病患者；④艾滋病患者；⑤各種精神疾病患者。對照組：肺功能測定FEV1>70%、無肺部及其他系統疾病者。其中COPD組25例，根據有無嗜煙分為嗜煙組（14例）、不嗜煙組（11例）。所有病例均符合世界衛生組織（WHO）制定的COPD診斷標準[3]，吸入支氣管擴張劑后FEV1/FVC<70%，支氣管舒張試驗陰性，同時本組患者符合以下指標：Vmax50%<70%預計值，Vmax25%<70%預計值，FEF 25%～75%<70%預計值。所有病例均處于穩定期。對照組17例，根據有無嗜煙分為嗜煙組（10例）、不嗜煙組（7例）。嗜煙組入選標準為：吸煙指數≥300支/年，吸煙指數=平均每天吸煙支數×吸煙年數。

COPD組、對照組患者的性別、年齡比較均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。見表1。

實驗所用Ⅱ型肺泡上皮細胞來源于A549系，購自中國科學院細胞庫（上海），細胞培養于RPMI1640培養液中，置于37℃，5% CO2孵箱中培養。

1.2研究方法

各組患者行常規電子支氣管鏡檢查，并予150 mL生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，回收率大于80%。

制備香煙煙霧提取物[4]（cigarette smoke extract，CSE）：將2支去過濾嘴香煙于一個注射器驅動裝置連接抽吸而燃著，10 min燃完，吸入的煙霧經另一個出口通入50 mL無血清培養液中制成懸液，懸液用1 mol/L NaOH調至pH 7.4，經0.22 μm微孔濾膜過濾備用，制備的香煙煙霧提取物在30 min之內用于實驗。各組處理方法：（1）對照組細胞在無血清的RPMI1640培養液中培養。（2）香煙煙霧提取物組細胞RPMI1640培養液中加入香煙煙霧提取物共同培養，模擬香煙對肺泡細胞的刺激作用。各組均在12 h 后留取部分培養液上清，-70℃保存。ELISA法檢測SP-D的表達。然后以地塞米松（DEX）2 μmol加入培養液中繼續培養細胞。72 h 留取各組細胞培養上清液，-70℃保存待檢。

1.3 觀察指標

ELISA法檢測各組患者支氣管肺泡灌洗液以及細胞培養液中 SP-D 的表達水平。采用R&D公司試劑盒，嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 統計學方法

所有數據均用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，同組治療前后比較采用配對t檢驗，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組支氣管肺泡灌洗液中SP-D的表達

COPD組患者支氣管肺泡灌洗液中SP-D表達明顯低于對照組，COPD組中嗜煙組支氣管肺泡灌洗液中SP-D低于不嗜煙組，差異均有統計學意義。對照組中嗜煙組支氣管肺泡灌洗液中SP-D低于不嗜煙組，差異有統計學意義。見表2。

2.2 各組細胞培養液SP-D的表達

與對照組比較，香煙煙霧提取物組細胞培養液中SP-D表達明顯降低，差異有統計學意義。香煙煙霧提取物組經地塞米松處理后細胞培養液中SP-D表達水平有明顯增加，差異有統計學意義。而對照組經地塞米松處理前后細胞培養液中SP-D表達水平無統計學意義。見表3。

3 討論

肺表面活性物質是由Ⅱ型肺泡上皮細胞和呼吸性細支氣管管壁上的Clara細胞合成和分泌的脂質與蛋白質的復合物，其主要生理功能是降低肺泡表面張力，防止肺萎陷和肺水腫[5-7]。目前發現有4種表面活性物質相關蛋白[8]，包括親水性的SP-A、SP-D和疏水性的SP-B和SP-C，SP-B和SP-C促進磷脂在肺泡表面膜的形成，降低肺泡表面張力，而SP-A和SP-D主要參與調節肺部天然免疫防御作用[9]。肺表面活性物質在生理情況下具有降低肺泡表面張力、抗水腫、穩定小氣道、抗氧化和蛋白酶所致肺損傷、調節局部免疫和炎癥反應等作用[10-12]。研究顯示，應用外源性肺表面活性物質進行干預可改善COPD肺功能，明顯抑制氣道炎癥，減輕肺組織損傷，抑制吸煙及彈性蛋白酶對肺組織的損傷，保護肺泡Ⅱ型上皮細胞的結構和分泌肺表面活性物質的功能，對COPD的發生起到預防和保護作用[13-15]。肺表面活性物質合成分泌障礙參與氣道阻塞發病過程，通過適當補充外源性肺表面活性物質或研制可能刺激內源性肺表面活性物質合成分泌的藥物，可能會開辟COPD新的治療途徑。

SP-D是肺表面活性相關蛋白的一種，對肺表面活性物質維持正常的生理功能有重要作用，可與各種細菌，病毒和真菌相互作用，使病原體更容易被吞噬細胞吞噬[16]。研究證明，SP-D基因缺陷型老鼠容易產生肺部炎癥，引起局部巨噬細胞聚集以及基質金屬蛋白酶水平升高，而且更易發生肺氣腫和肺損傷，可能與不能有效地清除壞死或凋亡細胞及它們的代謝物質有關[17，18]。體外實驗表明，SP-D可與銅綠假單胞菌相互作用促進清除，也可促進對煙曲霉菌孢子的吞噬和殺傷，支氣管束中存在的肺表面活性物質可通過減輕氣道壁萎陷及防止液橋形成等，在維持小氣道穩定、減低氣道阻力等方面起重要作用[19，20]，可能在COPD發病中有重要作用。

吸煙是慢性阻塞性肺疾病的一個重要的危險因素，在體內和體外的實驗均表明香煙的煙霧可以導致巨噬細胞壞死，而細胞壞死可能是肺組織破壞發展成肺氣腫的機制之一。有研究證明，COPD患者誘導痰中SP-D的表達可被明顯下調。本研究結果表明，COPD患者以及嗜煙者支氣管肺泡灌洗液中SP-D表達均明顯下降，這與有關學者對誘導痰SP-D的研究結果相一致。同樣，我們通過人類Ⅱ型肺泡上皮細胞培養實驗表明，在香煙煙霧提取物刺激下Ⅱ型肺泡上皮細胞SP-D的分泌明顯抑制，結果同我們的整體實驗結果不謀而合。通過地塞米松對細胞培養液中Ⅱ型肺泡細胞的干預表明，使用糖皮質激素對香煙煙霧提取物干預組的Ⅱ型肺泡細胞的SP-D分泌具有明顯上調作用，表明糖皮質激素有助于SP-D的合成，糖皮質激素可通過上調SP-D表達這一機制而對COPD具有治療作用。

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