miR21對宮頸癌Hela細胞及順鉑耐藥Hela/DDP細胞順鉑敏感性的影響

岳曉雪+苗勁蔚+路攀

[摘要] 目的 探討miR21基因表達水平對宮頸癌Hela細胞及其順鉑耐藥Hela/DDP細胞順鉑敏感性的影響。 方法 利用riboFECTTM CP轉染試劑分別將成熟miR21 mimic、inhibitor及其陰性對照試劑NC轉染至Hela與Hela/DDP細胞，并將Hela細胞分為mimic組、陰性對照（NC）組和空白對照（Blank）組，將Hela/DDP細胞分為inhibitor組、陰性對照NC組和空白對照（Blank）組。Real-time PCR檢測各組細胞中miR21的表達水平；MTT檢測各組細胞對順鉑的半數抑制率濃度（IC50值）。 結果 ①Real-time PCR檢測miR21在Hela/DDP中高表達，是Hela的（5.452±0.074）倍（P < 0.01）；轉染mimic后，Hela中miR21表達高于明顯NC組及Blank組（P < 0.01），NC組與Blank組相比，差異無統計學意義（P > 0.05）；轉染inhibitor后，Hela/DDP中miR21表達明顯低于NC組及Blank組（P < 0.01），NC組與Blank組相比，差異無統計學意義（P > 0.05）。②MTT結果顯示，轉染mimic后Hela細胞對順鉑敏感性下降，與NC組及Blank組相比，差異有統計學意義（P < 0.05），NC組與Blank組相比，差異無統計學意義（P > 0.05）；轉染inhibitor后Hela/DDP細胞對順鉑敏感性增加，與NC組及Blank組相比，差異有統計學意義（P < 0.05），NC組與Blank組相比，差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 ①miR21在Hela/DDP中高表達，在Hela中低表達。②上調miR21在Hela中的表達能明顯降低其對順鉑的敏感性，下調miR21在Hela/DDP中的表達能明顯增加其對順鉑的敏感性。

[關鍵詞] 宮頸癌細胞；順鉑耐藥細胞；miR21；順鉑；化療敏感性

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（c）-0025-04

[Abstract] Objective To detect the influence of miR21 gene expression on the sensitivity of cervical cancer Hela cells and cisplatin-resistant Hela/DDP cells to cisplatin. Methods Mature miR21 mimic， inhibitor and negative control （NC） miRNA were transfected into Hela and Hela/DDP cells by riboFECTTM CP. Hela cells were divided into mimic group， NC group and Blank group and Hela/DDP were divided into inhibitor group， NC group and Blank group. Real-time PCR was used to measure the expression of miR21 in each group. MTT was used to detect the half inhibitory concentration （IC50） of cisplatin. Results ①Real-time PCR results showed that the expression of miR21 was an average of （5.452±0.074） fold higher in Hela/DDP than in Hela （P < 0.01）. The expression of miR21 in mimic group was obviously higher than those in NC and Blank groups （P < 0.01）. The expression of miR21 in inhibitor group was significantly lower than those in NC and Blank groups （P < 0.01）. There was no statistical difference between NC group and Blank group in Hela and Hela/DDP cells （P > 0.05）. ②MTT results showed that the sensitivity of Hela to cisplat in decreased after mimic transfection while the Hela/DDP increased after transfected with inhibitor （P < 0.05）. There was no significant difference between NC group and Blank group （P > 0.05）. Conclusion ①The expression of miR21 is upregulated in Hela/DDP cells， while it wis down regulated in Hela cells. ②Over expression of miR21 in Hela can reduce its sensitivity to cisplatin obviously. Inhibition of miR21 in Hela/DDP can significantly increase its sensitivity tocisplatin.endprint

[Key words] Hela； Hela/DDP； miR21； Cisplatin； Cheo？鄄sensitivity

宮頸癌是女性生殖系統發病率最高的惡性腫瘤[1]。目前治療方案主要為手術輔助鉑類藥物化療及同步放化療。同步放化療相比單純放療可明顯提高中晚期宮頸癌患者的生存率，延長生存時間[2]。鉑類抗癌藥物作為術前或術后的輔助治療，在一定程度上改善了患者預后，在宮頸癌的治療中占有重要位置。有研究結果提示，某些基因的表達水平可能與腫瘤細胞對順鉑的敏感性相關[3-4]。microRNAs是一類單鏈非編碼小RNA，可通過調控不同靶點在腫瘤細胞對化療藥物敏感性方面發揮重要作用[5-6]。研究表明miR21與多種腫瘤耐藥相關[7-10]，但其表達水平與宮頸癌化療耐藥的關系仍不清楚。因此，本研究對細胞進行瞬時轉染外源性改變miR21的表達水平，進而探索其對Hela及Hela/DDP順鉑敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌順鉑耐藥細胞株Hela/DDP購自北那生物BNCC細胞庫，人宮頸癌親本細胞株Hela由軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所惠贈，順鉑（10 mg/支）購自山東齊魯制藥有限公司（批號：H37 021358）。DMEM、胎牛血清FBS購自Gibco公司，胰蛋白酶購自南京凱基生物科技有限公司，MTT、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，miRNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒購自天根生化科技有限公司；miR21 mimic、inhibitor、negative control及riboFECTTM CP購自銳博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 Hela、Hela/DDP細胞培養于含有10%FBS的DMEM培養基中（5%CO2、37℃），胰酶常規消化、傳代。

1.2.2 細胞轉染 采用riboFECTTM CP分別轉染mimic、inhibitor和NC。mimic組轉染50 nmol mimic，inhibitor組轉染100 nmol inhibitor，陰性對照（NC）組分別轉染mimic NC、inhibitor NC，空白對照（Blank）組不做轉染，轉染后培養箱繼續培養。

1.2.3 Real-time PCR檢測miR21表達 收集轉染48 h后的細胞，采用miRNA提取試劑盒提取總miRNA，加尾反轉錄試劑盒將miRNA反轉錄為cDNA，然后進行PCR擴增。反應體系（20 μL）：（2X）miRcute Plus miRNA Premix 10 μL，上下游引物各0.4 μL（下游引物為試劑盒配備），（50X）ROX Reference Dye 2 μL；cDNA模板各2 μL，ddH2O 5.2 μL。U6為內參。miR21上游引物序列為5′-CCCTCACAGACTGATGTTGAAA-3′。U6基因上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。PCR反應條件：95℃ 15 min變性；94℃20 s，64℃ 30 s，72℃，34 s（5個循環）富集目標miRNA；94℃，20 s，60℃，34 s（45個循環）退火延伸。反應均設三個復孔。Ct值（2-ΔΔCt）公式對數據進行相對定量分析。ΔΔCt=（CtmiR21-CtU6）轉染組-（CtmiR21-CtU6）對照組。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖活性 細胞轉染后繼續培養24 h，制備成單細胞懸液，5×103個/孔接種于96孔板中，100 μL/孔，設加藥組、調零組和空白對照組，每個濃度設3個復孔。貼壁后棄上清，分別在Hela和Hela/DDP細胞中加入180 μL培養基，20 μL終濃度為（0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160）μg/mL的順鉑，繼續培養48 h后每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），37℃避光孵育4 h，棄上清，加DMSO 150 μL/孔，充分振蕩使結晶溶解。酶標儀測定490 nm波長處的吸光度值，3個復孔取平均值。實驗重復3次，應用統計軟件繪制細胞存活率曲線并求出IC50值。

1.3 統計學方法

采用Graphad Prism 5.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hela/DDP與Hela對順鉑的敏感性

不同濃度順鉑作用48 h后，Hela/DDP及Hela對順鉑的IC50分別為（35.480±0.155）μg/mL、（5.260±0.206）μg/mL，前者是后者的（6.754±0.235）倍，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 Hela與Hela/DDP細胞miR21的表達

Real-time PCR法檢測Hela/DDP與Hela細胞中miR21的表達，結果顯示miR21在Hela/DDP與Hela中表達量分別為（5.450±0.081）、（1.000±0.002），前者是后者的（5.452±0.074）倍，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見圖2。

2.3 轉染mimic或inhibitor后miR21表達變化

2.3.1 Hela細胞miR21表達變化 轉染50 nm mimic后，結果顯示mimic組高表達，表達量為（7.611±0.025），與NC組（1.089±0.021）及Blank組（1.000±0.002）相比，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；NC組與Blank組相比，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖3A。endprint

2.3.2 Hela/DDP細胞miR21表達變化 轉染100 nm inhibitor后miR21的表達，結果顯示inhibitor組低表達，表達量為（1.181±0.030），與NC組（4.943±0.057）及Blank組（5.450±0.081）相比，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；NC組與Blank組相比，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖3B。

2.4 轉染mimic或inhibitor后細胞增殖的變化

2.4.1 Hela轉染mimic后細胞增殖的變化 給予不同濃度的順鉑，MTT檢測結果顯示mimic組IC50為（9.027±0.065）μg/mL，與NC組[（5.176±0.044）μg/mL]及Blank組[（5.083±0.030）μg/mL]相比，差異有統計學意義（P < 0.05）；NC組與Blank組相比，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖4A。

2.4.2 Hela/DDP轉染inhibitor后細胞增殖的變化 給予不同濃度的順鉑，MTT檢測結果顯示，inhibitor組IC50為[（2.517±0.080）μg/mL]，與NC組[（31.205±0.192）μg/mL]及Blank組[（31.255±0.140）μg/mL]相比，差異有統計學意義（P < 0.05）；NC組與Blank組相比，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖4B。

3 討論

miR21在實體瘤和非實體瘤中均呈現高表達[11-15]，如肺癌、胰腺癌、骨肉瘤、宮頸癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤等，也是腫瘤患者血清中第一個被檢測到的微小RNA[16]，在人類miRNA功能學研究中占有重要地位。Wang等[17]研究結果提示，miR21基因表達量在乳腺癌耐阿霉素細胞中較高，干擾miR21在親本細胞中的表達可改變其對阿霉素的耐藥性。在惡性膠質瘤細胞中，下調miR21的表達可增加惡性膠質瘤細胞對替尼泊苷敏感性[18]。改變卵巢癌及肺癌中miR21的表達也會產生類似的效果[19-20]。這些研究提示腫瘤細胞化療耐藥與miR21表達水平有關，然而關于miR21具體在宮頸癌化療耐藥方面的報道目前較少。

本實驗通過Real-time PCR法研究miR21表達水平在Hela及Hela/DDP細胞中對順鉑敏感性的影響。結果提示，miR21在Hela/DDP中的表達水平高于Hela（P < 0.05）。將mimic、inhibitor及其陰性對照轉入Hela與Hela/DDP細胞，結果提示，上調miR21在Hela細胞中的表達能明顯降低其對順鉑的敏感性，下調miR21在Hela/DDP細胞中的表達能明顯增加其對順鉑的敏感性。但是miR21是通過何種機制調控細胞化療敏感性仍不清楚。

miRNA裂解靶基因或抑制翻譯是通過與靶基因結合，因此推測miRNA功能的一個最直接手段是尋找下游靶基因。熒光素酶報告基因檢測系統發現miR21可與PTEN基因的3′UTR結合，進而抑制靶基因表達即PTEN mRNA是miR21的一個直接作用靶點[17]，這為進一步研究miR21在宮頸癌耐藥中的分子機制提供依據。

此外，本研究結果提示，miR21在Hela/DDP中表達量明顯高于Hela，且上調miR21的表達會降低Hela對順鉑的敏感性，下調miR21的表達會增加Hela/DDP對順鉑的敏感性。這為提高宮頸癌化療敏感性提供了新的靶點，為臨床上攻克宮頸癌化療不敏感難題提供了新思路。PTEN為miR21的直接靶點，故推測miR21可能通過調節PTEN影響宮頸癌細胞順鉑耐藥性，尚需進一步研究證實。

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（收稿日期：2017-09-21 本文編輯：李岳澤）endprint