重組DNA技術的教學實踐與思考

王建業 孟霞 朱禮倩 朱國強

摘 要 重組DNA技術是面向本院碩士研究生的一門選修課，皆在使新入學的新生掌握分子生物學實驗的方法和原理，為接下來的論文研究夯實基礎。本文中，作者把多年來主講該門課程的實踐經驗和心得體會進行總結。從課程內容設置、實驗原理的深度挖掘、綜合性實驗的設置、問題導向的研究性教學等方面進行展開。這既是對該門課程教學實踐的有益探索和總結，也為今后更好提升該門課程的教學質量奠定了基礎。

關鍵詞 重組DNA技術 教學 實踐

中圖分類號：G642 文獻標識碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkx.2018.06.025

Abstract The reorganized DNA technology is an elective course for the master's graduate students in our institute， all of which are making new students master the methods and principles of molecular biology experiments and lay a solid foundation for the research of the next paper. In this article， the author summarizes the practical experience and experience of the course over the years. From the contents of the course， the depth of experimental principles， the establishment of comprehensive experiments， and the research oriented teaching of problem oriented teaching. This is not only a useful exploration and summary for the teaching practice of this course， but also a foundation for improving the teaching quality of this course in the future.

Keywords recombinant DNA technology； teaching； practice

重組DNA技術是我院開設的一門選修課，授課對象為一年級碩士研究生，課時為36個學士，包括理論課和實驗課。該門課程在我院開課已有數十年，從最初的選課僅十余人發展至今天的近百人。在目前可見的參考書系列中，還沒有一本與重組DNA技術完全同名的教材，與之最為接近的參考書有國內出版的《基因工程原理》或者國外的《分子克隆實驗指南》。尤其是《分子克隆實驗指南》一書，一直被譽為分子生物學技術的入門寶典，包括上下兩冊，內容甚為豐富，涵蓋了分子生物學技術的各個方面，目前已是第三版。盡管如此，隨著生命科學學科整體的快速發展，各種新的分子生物技術不斷涌現，本門課程的講解內容也需要做到與時俱進不斷調整，以適應科學研究的形勢發展。最終目的在于保證研一學生進入實驗室后，能夠盡快進入角色，為順利開展論文研究工作打好必要的基礎。本人近年來一直承擔重組DNA技術課程的教學任務，對如何更好地開展該門課程的教學積累了一些心得體會，總結如下。

1 精選課程內容，做到重點突出

隨著當代生命科學的整體快速發展，各種分子生物學技術也快速涌現，這必然對重組DNA技術這門課的內容設置提出更高要求，哪些內容需保留或補充，需要考慮到當前科學研究的實際狀況。我們認為現代分子生物學或者基因工程真正的起步在DNA雙螺旋結構發現之后，這之后的標志性事件有很多，但包括限制性內切酶在內多種工具酶的發現，以及質粒載體的開發才真正標志著分子生物學黃金時代的到來，這一結論到今天仍不為過。今天，在生命科學所涉及的大部分研究中，工具酶和載體仍是必不可少的實驗材料。因此，工具酶、質粒載體以及PCR技術依然也必須應該是本門課程中必不可少的章節，需要重點講解。核酸探針雜交技術在分子生物學研究中曾一度有著相當高的應用面，也是講解內容之一。如早期在繪制基因組物理圖譜中，均需要用到Southern blot技術。但隨著測序技術的突飛猛進和成本大幅降低，尤其是二代、三代測序技術的發展，基于核酸探針的雜交技術在研究中的應用面少了很多。針對這種情況，鑒于探針標記中需要用到特定的聚合酶，我們把探針標記技術整合到工具酶章節中穿插做簡單講解，不再安排單獨章節來講。

PCR已是十分成熟的技術，很多研究生在本科階段已經接觸過甚至能夠熟練使用，而熒光定量PCR，作為PCR技術衍生出來的一種試驗手段，它的原理比一般PCR要復雜，牽涉到Ct值、溶解曲線等重要概念，尤其對引物設計要求較高，同時機器軟件的運行參數設定也需要一些指導。熒光定量PCR實驗結果的穩定性非常依賴于加樣的準確性，同樣的實驗內容，兩個人加樣的習慣性動作差異產生的結果差異會很大。由于熒光定量PCR屬于價格較高的儀器，教學實驗室通常不會購置。因此，我們在課堂僅講解熒光定量PCR實驗原理及其在科研中的應用實例，由于課時限制，不作具體的實驗教學安排，但要求學生借助網絡學習和參考其他文獻，對熒光定量PCR實驗中所需要注意的實驗步驟和細節加以總結以獲得好的結果。

2 實驗方法背后的原理要講透

我院的碩士生來自不同高校，有些在本科階段已進入實驗室，有了一定的實驗操作基礎。對大多學生，對某個具體的實驗可能知道怎么操作，但方法背后的原理卻不曾深究，這反映在一些學生在進入實驗室開展論文研究過程中，一旦遇到實驗困難進展不前時，缺乏獨立分析問題、找出癥結的能力。因此，我們認為在授課中，不僅要講具體的實驗步驟方法，對這種實驗方法的原理更需要講深講透，即使課時有限，不能面面俱到，也應該告知學生在哪些渠道能查到相關內容。比如，質粒提取是重組DNA技術的重點講解內容，溶液1、2、3是其中的三個必備試劑。溶液1中的葡萄糖、溶液3中的醋酸鉀的功能，大多學生很不清楚。實際上加了葡萄糖僅僅只是為懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子底部，因此，如果溶液1中缺了葡萄糖其實對質粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響?；厥蘸蟮乃嗪凶銐蚨嗟柠}，高濃度的鹽會水合大量水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發生沉淀。因此加入2倍體積乙醇并在室溫放置2分鐘后離心，質粒DNA就能得到很好沉淀。我們在科研過程中就曾觀察到個別研究生在提取質粒時，在酒精沉淀這一步會花費至少5分鐘以上，想當然的以為時間長一些會有好的效果，實際上放置于-20℃時間過長，反而會導致大量鹽的沉淀。講深講透這些實驗步驟背后的原理，很自然地就能扭轉研究生中存在的一些錯誤做法。

不同限制性內切酶buffer存在相通性，很多學生并未意識到這個問題。酶切消化是常規實驗項目，目前在國內市場流通的主流限制性內切酶廠家有4～5個，不同公司酶的buffer體系代號不一樣，但不代表成分有多大差別，我們認為作為研究生應該對此有清楚認識，做個有心人。美國NEB公司的buffer 2和buffer 3與日本Takara公司的buffer M和buffer H成分完全一樣，相互完全可以代替使用。即使是NEB公司的buffer 4，現在稱為Cutsmart buffer，與Takara公司的buffer T在成分上也高度相近。這些知識點的細化皆在讓學生認識到，盡管叫法不同，但這些buffer在化學組成上基本就是4種類型，主要差異在于鹽離子的濃度，目前常用到的限制性內切酶，通?？偰軐?種buffer中的一種。通過比較，使得學生今后在處理一些少見的復雜實驗時，知道怎么解決這些問題。比如在做雙酶切實驗時，偶爾會碰到無法找到共用buffer的情況，如果對buffer體系組成有了很透徹的認識，就能知道從低鹽buffer先酶切，再添加人工配置的鹽成分，調制成高鹽buffer，完成后續的酶切任務，而不必采用其它繁瑣的方法。

3 開展綜合性實驗，打通知識鏈

為了與研究生的科研實際任務相對接，我們不單獨為某個具體的實驗項目開設實驗，而是設計一個綜合性實驗，將各個主要知識點打通串聯在一起，完成時間為2周。這個實驗如下設置：我們提供含有目的基因的質粒及引物，要求學生對該目的片段進行擴增，然后與T載體連接。自行制作DH5感受態細胞，連接產物轉化感受態細胞，涂布平板。通過藍白斑篩選，挑取白斑接種LB 肉湯擴增，小量提取質粒進行鑒定。通過選定的限制性內切酶酶切鑒定，對陽性克隆送公司測序，要求學生能夠通過軟件讀懂測序圖譜，并對測序結果進行同源性比較。

由于該綜合性實驗需要很多相關儀器，而教學實驗室又不可能配置全，我們會將學生根據所屬學科特征，充分利用各個導師實驗室已有的儀器設備條件，將所有選課學生分成4～5人為一組，利用其所在的各個導師實驗室來完成上述實驗項目。對實驗中出現的問題，隨時通過電話等各種通訊工具保持溝通。要求各小組將實驗結果以PPT形式在課堂上匯報，教師對每個小組的圖片以及PPT質量進行點評和結果分析，重點放在質粒的提取質量、瓊脂糖凝膠電泳圖片質量以及酶切結果分析?？傊?，通過一個完整的實驗周期，使得學生對PCR擴增、連接產物轉化、質粒提取和酶切鑒定都有了具體深入的掌握。

4 在不同章節中穿插演示生物軟件的使用

生物信息學在生命科學研究中占有重要地位，已成為一門獨立的課程，這其中包括一些分子生物學軟件的使用。在不同章節中穿插講解一些常用的分子生物學軟件，對于研究生順利開展課題研究十分必要。在限制性內切酶章節中，我們給大家演示Primer 5.0和DNASTAR軟件在酶切位點分析中的應用。在PCR技術章節中，我們以Primer 5.0軟件為代表，講解其在引物設計中的應用，該軟件界面清晰、簡潔，在引物設計上使用頗廣。在講解測序技術章節中，我們告知學生不能完全依賴商家提供的序列，必須自己學會運行Chromas程序來觀察峰形質量來評價測序結果的可靠性，這包括如何去除不可靠序列，如何看待測序中的背景峰、套峰現象對測序結果的影響等。我們也會演示如何利用DNASTAR軟件包中Edit程序對序列進行編輯，利用SeqMan軟件對序列進行打包，用Megalign軟件對不同序列進行同源性比對等。我們還會講解MEGA、Clustal軟件在基因進化樹和序列比對中的廣泛使用。

在掌握與該門課程相關的軟件基礎上，對其它一些軟件，包括一些繪圖軟件，鑒于課時有限，我們僅列出這些軟件的名稱，推薦學生通過各種途徑自主學習。

5 將實驗操作中暴露的細節問題引入課堂

根據筆者的長期觀察，在不少學生的科研實踐中往往存在一些習慣性操作，看似不違反操作規程，但過于機械缺乏靈活性的變動，這些操作實際上會影響到實驗結果，我們把這些問題進行總結，帶到課堂上與學生分析討論。比如，在提取質粒的最后一步，參考書上要求是自然晾干或置于37℃溫箱，但時間都比較長，再用水或TE溶解質粒。而現在隨著實驗硬件的大為改善，離心濃縮儀在很多實驗室已經愈發普遍，只需5～10分鐘，質粒就能完全干燥。如果仍舊習慣性的加入TE緩沖液后直接吹打溶解，質粒很容易斷裂，造成提取的質粒質量不高，超螺旋質粒比例下降。我們主張的做法是，在加入緩沖液后，將Eppendorf管在37℃自然浸泡10分鐘，以讓經過抽真空干燥的質粒自然軟化，然后再用槍頭輕柔吹打混勻。這些細節在正規參考書上不會涉及，需要學生自己在實踐摸索中總結。我們把在科研實踐中發現存在的這些問題，在課堂上就給學生指出，有利于學生在進入實驗室后的初期研究中就能夠得到好的實驗結果。

再比如，在酶切消化實驗中，酶的加入量一般在0.5～1 l范圍。由于酶都保存于50%甘油體系中，粘稠度高于水，移液器吸取0.5 l，實際上都不到0.5 l，有些學生會刻意調整刻度多加一下，實際上完全沒有必要。這有兩方面原因，一是按照現有的20 l酶切體系和選擇性內切酶的包裝，消化1 g質粒，酶用量即使只有0.5 l，實際上也過量5～10倍；此外，由于甘油的粘稠度，沾在吸頭上也有不少的量，可以彌補吸取量的不足，這也是酶在最后一步加入的原因。把這些知識點在課堂中與學生進行交流，讓學生盡早明白一個道理，分子生物學實驗很多時候確實要求加樣準確、操作嚴謹規范；另一方面，很多試劑加入量允許一定的幅度波動，甚至是無法避免的，不必過分拘泥刻板要求。

總之，重組DNA技術是一門理論和實踐操作結合性很強的課程，涉及的內容知識點很多。主講教師應該有在一線多年從事分子生物學研究的扎實背景，還能不斷跟進當代生命科學研究中出現的新技術方法并整合到自己的課堂教學中。以立足于問題導向的教學模式在本門課堂教學中應給予足夠重視，在教學內容設置上不求面面俱到、但求重點突出。鼓勵學生充分利用互聯網平臺等各種渠道拓展課堂中未能涉及或者充分展開的內容，以滿足實際科研的需要。在今后教學中，我們還要不斷提高課件的制作水平，做到圖文并茂，把重組DNA技術這門課程真正打造成面向本院碩士研究生的一門精品課程。

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