碳酸氫鈉誘導肝癌細胞凋亡機制研究

張巖 喬錄新 曾靜 徐軍 石英

[摘要] 目的 探討碳酸氫鈉（NaHCO3）對肝癌生長的影響及其機制。 方法 5只7周齡裸鼠于無特定病原體（SPF）條件下的層流架中飼養，皮下注射肝癌細胞株HepG2細胞構建肝癌模型，并通過腫塊內局部注射5%NaHCO3，體內研究肝癌腫塊生長及組織壞死。Calcein/PI染色和流式細胞技術體外研究不同酸堿環境和NaHCO3作用下HepG2凋亡情況。蛋白印跡技術檢測NaHCO3作用下HepG2細胞凋亡調控蛋白Bax/bcl2表達水平。 結果 5只裸鼠肝癌5%NaHCO3局部注射4周，3只腫塊明顯縮小，1只腫塊長大，1只小鼠實驗過程中死亡。5%NaHCO3 3/4、1/2、1/4、1/8、1/16和0（對照）培養基體積占比，Calcein/PI染色顯示HepG2細胞凋亡率依次減低。流式細胞分析顯示5%NaHCO3 1/2、1/4、1/8、1/16體積占比和對照組細胞凋亡率也依次減低。Calcein/PI染色顯示培養基pH6.0、pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25、pH7.5、pH7.75、pH8.0的HepG2細胞凋亡率在pH7.0～7.25最低，隨著酸堿度的增加凋亡率逐漸增加。流式細胞分析培養基pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25和pH7.5組細胞凋亡率變化顯示類似結果。5%NaHCO3占1/4培養基體積比條件下HepG2細胞促凋亡的Bax mRNA和蛋白水平與對照相比較無明顯變化，而抑凋亡的bcl2 mRNA和蛋白水平明顯低于對照組。 結論 NaHCO3可通過改變肝癌組織內環境酸堿度，繼而抑制凋亡功能蛋白blc2誘導肝癌細胞凋亡。

[關鍵詞] 碳酸氫鈉；肝細胞癌；凋亡；治療

[中圖分類號] G735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（b）-0009-04

[Abstract] Objective To explore the apoptotic mechanism of hepatocellular carcinoma （HCC） induced by sodium bicarbonate （SB）. Methods HepG2 cells were implanted the subcutaneous of 5 athymic mice （7-week age） to form hepatocarcinoma mouse model and the growth and necrosis of hepatocellular carcinoma was observed under the condition of local mass injection of 5% SB. The apoptosis of hepatocellular carcinoma cell line HepG2 was observed by Calcein/PI staining and flow cytometry at SB exposure and different pH gradients. The expression of Bax/bcl2 were also detected in HepG2 cells under SB exposure by real-time PCR and western blotting. Results Animal in vivo studies revealed that 5% SB local injection for 4 weeks could inhibit tumor growth and cause tumor necrosis in 3 of 5 hepatocarcinoma mice. One hepatocarcinoma mice died and another mice had an enlarged tumor. 5% SB was diluted to the volume ratio 3/4， 1/2， 1/4， 1/8， 1/16 and negative control by DMEM and Calcein/PI staining in vitro showed that HepG2 apoptosis mice decreased in turn. Flow cytometry showed the similar results in 5% SB volume ratio： 1/2， 1/4， 1/8 and 1/16. The medium DMEM was titrated to pH6.0， pH6.25， pH6.5， pH6.75， pH7.0， pH7.25， pH7.5， pH7.75 and pH8.0. The lowest rate of HepG2 apoptosis was at pH7.0 and pH7.25. As the increasing of acidity or alkalinity， the apoptosis rate of HepG2 increased gradually. Flow cytometry also showed the similar results. Compared with control， Bax mRNA and protein expression in SB exposed HepG2 cell were not changed， but bcl2 mRNA and protein expression were decreased. Conclusion SB can induce HCC apoptosis by changing the internal environmental pH and inhibiting the expression of apoptotic protein blc2.

[Key words] Sodium bicarbonate； Hepatocellular carcinoma； Apoptosis； Treatment

由于慢性乙型肝炎病毒感染人口基數較大，肝癌在中國有很高的發病率[1]。因此，對于肝癌的有效治療具有非常重要的意義[2-3]。目前肝癌治療手段主要為手術切除和介入治療[4]，而肝癌介入治療主要為肝動脈栓塞化療和射頻消融[5-6]。有研究發現碳酸氫鈉可提高肝動脈栓塞化療對肝癌的療效[7-8]，但確切機制尚不完全清楚。本研究通過體內外研究方法探索碳酸氫鈉對肝癌生長的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞和實驗材料

5只7周齡胸腺缺失小鼠（裸鼠）購自中國人民解放軍軍事醫學科學院，HepG2細胞株來自北京市肝病研究所。小鼠抗bcl2單克隆抗體購自Santa Cruz公司（USA）；兔抗bax多克隆抗體購自Abcam公司（Cambridge，UK）；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、β-actin單克隆抗體購自Sigma公司（St. Louis，MO）；辣根過氧化物酶標記抗小鼠和抗兔二抗購自Jackson公司（USA）；鈣黃綠素-AM（Calcein）購自Invitrogen公司（Eugene，OR）；DMEM培養基，青/鏈霉素購自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）購自羅氏公司（IN， USA）；鼠FITC-IgG1/PE-IgG1單抗為Pharming公司產品；其他相關分析純試劑購自國內生產公司。實驗組與對照組小鼠給予相同光照、室溫、飼料等飼養條件，并在無特定病原體（SPF）條件下的層流架中飼養。嚴格按照《首都醫科大學實驗室實驗動物使用管理規定》使用實驗動物，實驗動物合格證號2012-0004。

1.2 細胞培養和Calcein/PI吸收試驗

無菌條件下，使用含15%胎BSA和1%青/鏈霉素的DMEM培養基將復蘇的HepG2細胞平鋪在12孔培養板，細胞濃度為1×104/cm2。并按照實驗設計加入特定的酸性或堿性液體，置于37℃、體積分數為0.05 CO2恒濕培養箱溫育24 h進行相關細胞和蛋白實驗。Calcein/PI吸收試驗通過細胞培養基中加入1 μg/mL Calcein-AM 37℃溫育30 min，再加入10 μg/mL PI溫育15 min，倒置熒光顯微鏡下觀察并計數存活和凋亡的神經細胞。Calcein-AM染成活細胞，呈綠色；PI染凋亡/死亡細胞，為紅色，其中死亡細胞核固縮，凋亡細胞核大而松散。40倍物鏡下每個實驗點取3個視野計數的平均數。通過熒光顯微鏡下細胞計數，并依據公式：PI/（PI+Calcein-AM）×100%計算凋亡細胞所占比例。

1.3 流式細胞技術

去除處理后的HepG2細胞培養基，加入1×PBS稀釋的儲存濃度為10 mg/mL的HE于二甲基亞砜（DMSO中儲存）（Polysciences， Warrington，PA），使終濃度為50 μg/mL。避光，37°C孵育10 min。最后用BDFACSDiva流式細胞儀對細胞進行分析（BD FACS CantoTM Ⅱ）。HE在490 nm波長處被激發，在620 nm波長處可被檢測到。儲存10 000個細胞的數據，然后用CellQuest軟件進行分析。

1.4 核酸提取和實時定量PCR檢測

通過RNA提取試劑盒（Biomed Biology，北京）提取總RNA，應用Superscript HI Rt-PCR首鏈合成系統試劑盒（Invitrogen），將提取的RNA反轉為cDNA，具體操作按照說明書進行。采用Taqman探針法進行實時定量PCR（qPCR）檢測Bax和blc2 mRNA水平。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因為內參。引物和探針由上海Invitrogen公司合成，具體實驗步驟和引物探針見文獻[9]。依照相對于對照組基因拷貝增減的倍數等于2-△△CT的相對定量法計算實驗組基因變化。使用儀器為美國TaqMan 7900 TqPCR檢測系統。

1.5 蛋白提取與蛋白印跡

HepG2細胞通過RIPA裂解液裂解，蛋白濃度通過BCA 蛋白檢測試劑盒檢測（Biomed Biology，北京）。蛋白質印跡一抗用1×PBS+3% BSA（1∶1000）稀釋，二抗用1×PBS+3%脫脂牛奶（1∶1000）稀釋。12%聚丙烯酰胺凝膠蛋白（30 μg）上樣，30 V電壓轉膜（硝酸纖維素膜）過夜，5%脫脂牛奶封閉，一抗（抗小鼠bcl2和抗β-actin單克隆抗體與抗兔Bax多克隆抗體）37℃溫育1 h，二抗（對應的辣根過氧化物酶標記抗小鼠二抗和抗兔二抗）室溫1 h，暗室發光洗片并掃描成像。

1.6 肝癌動物模型構建與碳酸氫鈉處理

培養HepG2細胞，使得細胞濃度達到6×106/mL。取5只裸鼠皮下注射上述HepG2細胞0.2 mL，SPF條件下飼養2周見小鼠皮下種植HepG2細胞部位長出實性腫塊，且逐漸長大，考慮荷瘤成功。第3周開始隔日1次0.2 mL NaHCO3腫塊內注射，連續4周。觀察腫塊生長情況。

1.7 石蠟切片和HE染色

通過頸部脫臼處死實驗小鼠并迅速解剖分離腫瘤組織，10%甲醛固定，乙醇脫水并予以二甲苯透明，石蠟包埋，用切片機切成6 μm厚薄片，45℃恒溫箱中烘干，將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色5 min，酸水及氨水中分色，各10 s，流水沖洗1 h后入蒸餾水5 min，入70%和90%酒精中脫水各10 min，入酒精伊紅染色液染色3 min，染色后的切片經純酒精脫水，再經二甲苯使切片透明，將已透明的切片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。顯微鏡下讀片拍照。

1.8 統計學方法

采用PASW statistics 18統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 局部注射碳酸氫鈉對肝癌腫塊生長和肝癌組織壞死的影響

5%NaHCO3局部注射組5只小鼠4周觀察發現，3只腫塊明顯縮小，1只療效較差出現腫塊進一步長大，1只小鼠實驗過程中死亡（圖1A）。針對肝癌組織的HE染色發現5%NaHCO3干預可引起腫塊組織壞死（圖1B）。

2.2 碳酸氫鈉對肝癌細胞凋亡的影響

5%NaHCO3被按照不同體積占比替換肝癌細胞株HepG2細胞培養基DMEM。在5%NaHCO3完全替換DMEM情況下，HepG2細胞迅速死亡。因此，實驗所用5%NaHCO3所占DMEM培養基體積比依次為3/4， 1/2，1/4，1/8，1/16和0（對照）。HepG2細胞培養24 h后觀察細胞凋亡情況。研究發現，細胞凋亡率與5%NaHCO3所占培養基體積比呈正相關，在NaHCO3（1/8）組對HepG2細胞生長影響即明顯減弱。通過流式細胞進一步分析細胞凋亡情況，因NaHCO3（3/4）組細胞幾乎全部死亡，故觀察NaHCO3（1/2）、NaHCO3（1/4）、NaHCO3（1/8）、NaHCO3（1/16）和對照組，其細胞凋亡率依次減低。見圖2（封三）。

2.3 不同pH值條件下肝癌細胞凋亡情況

由于HCO3-是調節人體體液酸堿平衡重要的堿性陰離子，假設NaHCO3通過形成腫瘤細胞外液堿性微環境誘導肝癌細胞凋亡。由此，滴定HepG2細胞培養基DMEM酸堿度，形成pH6.0、pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25、pH7.5、pH7.75、pH8.0等不同pH值DMEM培養基。HepG2細胞分別在上述培養基中培養24 h后觀察細胞凋亡情況。Calcein/PI染色顯示pH7.0～7.25細胞凋亡率最低。隨著酸度或堿度的逐漸加大，細胞凋亡率逐漸增高。通過流式細胞進一步分析細胞凋亡情況，因pH6.0、pH7.75和pH8.0組細胞死亡率極高，故觀察pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25和pH7.5組，其細胞凋亡情況和上述結果類似。見圖3（封三）。

2.4 碳酸氫鈉通過抑制凋亡調控蛋白bcl2的表達誘導肝癌細胞凋亡

為了進一步探索碳酸氫鈉所導致的肝癌細胞凋亡機制，取細胞凋亡調控兩個重要蛋白Bax/bcl2進行研究，通過實時定量PCR和蛋白印跡方法觀察5%NaHCO3對Bax/bcl2 mRNA和蛋白表達水平的影響。研究發現5%NaHCO3占1/4培養基體積比條件下培養24 h的HepG2細胞促凋亡的Bax mRNA表達水平改變不明顯，而bcl2 mRNA表達水平明顯減低。進一步蛋白研究顯示實驗組Bax無明顯改變。抑凋亡的bcl2相對于β-actin平均蛋白表達水平明顯減低。見圖4。

3 討論

肝癌是肝細胞起源的惡性腫瘤，占世界男性惡性腫瘤發病第5位和女性第9位[10]。我國人群發生肝癌多數與慢性乙型肝炎病毒感染相關[11]。目前對于肝癌治療多數采用手術腫瘤切除、局部介入治療以及生物靶向治療等。介入治療往往聯合肝動脈栓塞化療和經皮肝穿刺肝癌射頻消融治療等[5，12]。有報道NaHCO3被用于肝動脈栓塞化療的輔助治療。

腫瘤細胞的生理活動離不開穩定的細胞內和組織間液的pH值。人體血液正常pH值為7.35～7.45，組織液pH值一般為7.0～7.5，而細胞漿的pH值是7.20～7.45[8]。不同組織液和細胞液pH值可以存在較大差異。細胞生命活動過程中會產生多種酸性和/或堿性物質影響身體內環境的酸堿度，而另一方面正常人體存在著非常有效的酸堿調節系統用來維持機體的酸堿平衡，比如血液HCO3-/H2CO3的迅速調節作用，肺通過呼出二氧化碳排出體內可揮發性酸，腎臟通過腎小球排出不可揮發性酸性代謝產物以及腎小管重吸收NaHCO3和電解質來相對持久性調節機體酸堿平衡等[13-14]。

NaHCO3通過改變腫瘤細胞或組織局部酸堿度來抑制腫瘤細胞生長和正常功能活動理論上是可行的[15-16]，因為其生長和正常功能活動所需要的酶的活性受到抑制，不能發揮其正常功能。本研究也證實NaHCO3改變肝癌組織細胞內環境酸堿度，通過細胞凋亡功能蛋白抑制肝癌腫瘤生長。

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（收稿日期：2018-04-18 本文編輯：李岳澤）