關于熒光定量PCR在預測微生物學中的運用分析

韋蘭芳

【摘 ? 要】 預測微生物學是由計算機、微生物與統計學等學科綜合而成的一種新型學科，主要利用數學語言對微生物生長與死亡規律進行預測、描述。熒光定量PCR主要利用熒光信號對聚合酶鏈式反應進程進行監測，通過標準曲線定量分析位置模板。本文主要對熒光定量聚合酶鏈式反應技術進行研究，并對其在預測微生物學中運用進行分析，以供相關人士參考。

【關鍵詞】 預測微生物學;運用分析;熒光定量聚合酶鏈式反應

Application and Analysis of fluorescent quantitativePCR in predicting Microbiology

Wei Lanfang

（Anhui Kebo Product testing Research Institute company Ltd. ? 230000）

[Abstract] Predictive microbiology is a new kind of discipline， which is composed of computer， microorganism and statistics. It mainly uses mathematical language to predict and describe the law of microbial growth and death. Fluorescence quantitative PCR mainly uses fluorescence signal to monitor the process of polymerase chain reaction and quantitative analysis of position template by standard curve. In this paper， the technology of fluorescent quantitative polymerase chain reaction （FQPCR） is studied， and its application in predictive microbiology is analyzed for the reference of relevant people.

[Keywords] predictive microbiology; applied analysis; fluorescence quantitative polymerase chain reaction

聚合酶鏈式反應技術源于國外，能夠導致核算暴增，促進微觀分子可視化。在生物科學技術快速發展過程中，聚合酶鏈式反應技術要求越來越高，從而產生了熒光定量聚合酶鏈式反應。因為熒光定量聚合酶鏈式反應技術具有高效與特異等優點，所以在醫藥衛生、微生物與農業等科學領域中具有廣泛應用空間。在微生物應用過程中需要通過科學技術進行預測，判斷微生物產品是否安全、可靠。

1 ?熒光定量PCR技術

1.1 ?技術原理

熒光定量聚合酶鏈式反應技術有水解探針法與熒光染料法等。水解探針法主要能夠將探針完整性破壞掉，導致能量傳遞結構出現不穩定現象而崩潰，從而出現熒光信號。當聚合酶鏈式反應一輪之后便可以收集到一次熒光信號，從而對整個反應過程進行動態檢測。染料法屬于常用檢測技術，主要通過綠色激發波長染料和DNA雙鏈小溝結合產生熒光信號，且信號收集量和聚合酶鏈式反應產物增加量相等[1]。較傳統技術方法而言，熒光定量聚合酶鏈式反應技術能夠確定優勢微生物群落，良好功能微生物類群。在熒光定量聚合酶鏈式反應技術應用過程中可能會發生假陽性，在樣本定量分析時可通過死菌DNA結合避免其擴增。

1.2 ?特征

通常情況下PCR產物都需要通過瓊脂糖凝膠電泳與溴化乙錠染色紫外光的觀察結果來進行檢測，不僅需要耗費大量時間，還需要使用多種儀器設備，且染色劑對于人體存在著一定的危害。熒光定量PCR克服了傳統PCR的一些缺陷，主要表現在以下幾個方面。

1.2.1 ?特異性 ? ?熒光定量PCR具有非常良好的準確性，原因在于它使用針對靶序列設計的特異性探針對定量分子進行識別，探針與引物的雙重控制模式下，假陽性低，可以最大化保障試驗結果的準確性。

1.2.2 ?線性關系 ? ?熒光信號的出現與擴增產物之間呈現出對應的關系，熒光信號檢測可以直接對產物進行定量操作。

1.2.3 ?高靈敏度 ? ?熒光定量PCR檢測技術綜合了多種技術手段，包括PCR技術、激光技術、數碼現象技術等在內，檢測靈敏度有所保證。

1.2.4 ?操作簡便 ? ?該技術的自動化水平較高，無論是擴增還是檢測環節都可以在全封閉的管內進行，降低了溴化乙錠可能產生的影響。另外，在不需要開蓋的前提下可以實現擴增與檢測的同步完成，無需后期處理，在3h內完成多個樣品的定量分析。

2 ?預測微生物學運用

2.1 ?臨床微生物檢驗應用

在臨床診斷與治療過程中，常會通過實驗方式對各種微生物標本進行檢驗，從而為醫師臨床疾病判斷和治療方案制定提供重要依據。臨床醫務人員事先做好標本采集工作，通過規范采集提高標本準確性，不會對臨床微生物預測分析造成直接影響。臨床醫生與檢驗人員必須遵循醫院標本采集規范，在微生物檢驗和預測分析過程中重視臨床溝通。醫生在臨床工作過程中通常都以微生物檢驗報告為主，護理人員需要將檢驗單交給患者家屬，并對樣本采集注意事項進行補充說明。真菌、病毒與細菌等是臨床微生物檢驗常見物，熒光定量聚合酶鏈式反應技術在這些微生物檢驗中具有廣泛應用空間。在臨床真菌檢驗工作開展方面，檢驗人員可以通過熒光定量聚合酶鏈式反應技術檢測樣本，臨床結果顯示出來的特異度能夠達到100%，技術檢驗結果精確性很高。在病毒檢驗方面，臨床微生物檢驗人員可以選擇各種類型樣本為研究對象，通過熒光定量PCR技術檢測出各種混合基因型[2]。比如在手足口病疾病臨床診斷過程中，醫師可以通過熒光定量聚合酶鏈式反應技術快速檢測出來，這對臨床醫師預測、評估患者病情具有重要意義。檢驗人員可以使用熒光定量聚合酶鏈式反應技術將細菌中包含的各種類型基因檢測出來，且臨床檢驗特異性與靈敏度都很高，能夠有效提升臨床檢驗效果與工作效率。

2.2 ?乳品微生物檢測應用

益生菌是乳品微生物中的一部分，攝入足量益生菌微生物能夠促進宿主健康成長。以生物數量關乎宿主生命健康，可以通過貨架期內產品保持宿主腸內以生物存活量。在益生菌產品使用方面，首先需要對產品安全質量進行檢測。在乳品微生物檢測方面，可以通過熒光定量聚合酶鏈式反應技術降低檢驗成本，縮短益生菌鑒定時間。在定量市售產品益生菌含量測定方面，是呀人員需要合理設置引物進行實時熒光定量聚合鏈式反應技術檢測，這種檢測方式能夠獲得較好靈敏度，其在酸奶制品檢測方面具有一定應用價值。國外有學者將熒光定量聚合酶鏈式反應技術和核酸染料融合形成一種新的檢測技術，能夠將活性雙歧桿菌與乳酸菌區分開來，對兩種生物菌數量進行數據統計。相對于平板計數統計而言，這種熒光定量PCR技術用時更短，能夠將檢測時間縮短到3小時。在發酵乳制品檢驗方面，熒光定量聚合酶鏈式反應技術能夠對乳制品原有乳酸菌種類進行檢測，并確定各種菌群規模量。在成品干酪制作方面，有益微生物能夠對這種產品風味產生直接影響。干酪產品可能會因為選擇媒介缺乏而無法量化表面細菌。在涂抹型干酪檢測過程中，檢驗人員可以通過熒光定量聚合酶鏈式反應技術檢測出產品棒狀桿菌功能與生態系統。

2.3 ?食源性致病菌檢測

傳統的食源性致病菌檢測方案包括菌分離培養、生化鑒定等多個步驟，不僅時間耗費較長，且檢測結果準確性存在一定的缺陷。目前生物學診斷方法被廣泛用戶食源性疾病的快速檢測當中，其快速、高效的特征也明顯改進了傳統方案的缺陷。具體來看，微生物快速檢測分析以快速精準的致病菌監測方案為基礎，可以對食品中毒的不同特異性基因作為檢測食源性致病菌的標靶基因。有研究針對南美白對蝦的食源性致病菌進行了檢測，通過DNA提取、多重實時熒光PCR技術，成功地進行了檢測。結果表明，無論是人工接種還是自然污染的生蝦樣品當中都檢測出了食源性致病菌。在目前的食源性致病菌檢測工作當中，考慮到某些食品的背景菌群可能會在一定程度上影響檢測結果的準確性，因此在檢測環節可以視情況增加一個滅菌步驟，除去實驗樣品中的背景菌群。而多重實時熒光PCR方法并不會受到背景微生物群的嚴重干擾，在特異性與擴增效率上都能保持較高的水平，其特異性的優勢也能確保該方案可以適用于不同食品基質中的致病菌檢測。需要注意的是某些研究中需要利用PCR之前的增菌過程來更好地促進反應靈敏度的提升，但考慮到這一過程需要耗費數個小時以上的時間，對于試驗效率會產生一定的不利影響。

3 ?結語

熒光定量聚合酶鏈式反應技術在乳制品微生物與臨床微生物檢驗、判斷等方面具有較高應用價值。在預測微生物學熒光定量聚合酶鏈式反應技術運用過程中，需要對以往缺陷進行改進，選擇符合實際需求的樣品，通過現代科學技術將檢驗結果顯示出來。在微生物檢驗方法應用方面，要不斷探索熒光定量聚合酶鏈式反應技術應用模型，通過預測模型優化、創新提高微生物檢驗效果，避免微生物生產應用出現安全問題。

參考文獻：

[1] 朱軍偉，杭鋒，王欽博，等.實時熒光定量PCR技術在乳品? ? ?微生物學中的應用研究進展[J].安徽農業科學，2014（15）.

[2] 王宇，靳偉東，蘭凱，等.熒光定量PCR技術在臨床微生物? ? ?檢測中的應用[J].中國衛生標準管理，2015（30））.