玉米芯水熱預處理酶解糖化

孫軍濤 張智超 肖付剛 蘭天璐 詹靜 宋啟偉 胡錦輝 郅文莉

摘要：優化玉米芯超微粉碎后水熱預處理工藝，用掃描電鏡和高效液相色譜儀分別對水熱預處理后的玉米芯組織結構和酶解糖化組分進行分析。結果表明：水熱預處理溫度為190℃、時間60 min時，提取液中總糖含量最高（314 mg/g）;玉米芯水熱預處理后結構呈卷曲狀，隨著溫度升高卷曲越明顯，結構越疏松，表面呈現微孔結構;水熱預處理溫度190℃、時間60 min時，提取液中葡萄糖、木二糖、木三糖和木四糖的得率分別為0.001 mg/g、16. 740mg/g、4.306 mg/g和3.164 mg/g，提取液酶解后組分中葡萄糖、木二糖、木三糖和木四糖的得率分別為4.774 mg/g、64. 437 mg/g、6.853 mg/g和1.835 mg/g。

關鍵詞：水熱預處理;玉米芯;木聚糖酶;酶解糖化

中圖分類號：TS209

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（ 2019） 03-0696-05

將木質纖維素原料高效地轉化為單糖或低聚糖，進一步發酵成酒精，對開發新能源，保護環境具有非常重要的現實意義，是實現社會可持續發展的重要途徑[1-3]。中國是一個農業大國，玉米是中國三大糧食作物之一。據統計，2017年中國玉米總產量約為2.16x108 t，按照3 kg玉米產1 kg玉米芯計算，2017年可產生0.72x108 t左右的玉米芯。玉米芯木質纖維素是潛在的生物質資源，可作為生產乙醇和功能性低聚糖的原料。

水熱預處理方法（ Hydrothermal pretreatment）是在高溫條件下（160 - 240℃）水自電離產生氧離子形成水合離子，使得對酸不穩定的糖苷鍵斷裂，從而使半纖維素解聚并且從生物質基質中溶解出來，并使部分纖維素水解，以消除對纖維素酶的空間阻礙，從而提高酶解效率[4]。在眾多的預處理方法中，由于水熱預處理方法不需要添加任何化學試劑，水解產物中抑制乙醇發酵的因素極少等優點[5-8]，此作為一種新興的綠色環保處理技術已成為近年來研究的熱點。

本研究選擇玉米芯為原料，通過對水熱預處理工藝條件的優化，以及結構分析和酶解糖化后組分分析，為玉米芯木質纖維素資源的全組分高值化利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

玉米芯取自河南省許昌縣。木聚糖酶購自上海源葉生物科技有限公司，3，5-二硝基水楊酸購自國藥集團化學試劑有限公司，葡萄糖（純度>98%）、木糖（純度>98%）和木二糖（純度>98%）購自上海化成發展有限公司，木三糖和木四糖購自上海甄準生物科技有限公司，其余試劑均為國產分析純。

掃描電子顯微鏡（ EVO LS15），英國蔡司公司產品;傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR-650），天津市港東科技發展股份有限公司產品;分析天平（ FA1004B），上海佑科儀器儀表有限公司產品;紫外分光光度計（T6），北京普析通用儀器有限責任公司產品;超微粉碎機（NLD-6DI），濟南納力德超微粉碎技術公司產品;高效液相色譜儀（ 1260 infinity），安捷倫科技（中國）有限公司產品;反應釜，上海予華科技儀器設備產品。

1.2 測定方法

1.2.1 還原糖含量的測定還原糖含量的測定采用DNS法[9]。

1.2.2 總糖含量的測定 向待測液中加入終質量濃度為72 g/L的濃硫酸，沸水浴2h，用6 mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性。按還原糖的測定方法測定待測液中總糖含量[iO]。

1.3 水熱預處理玉米芯

超微粉碎后的玉米芯，按照1：6（質量體積比）的料液比加水后置于高壓反應釜中，在150 -190℃下分別處理20 min、40 min、60 min、80 min和100nun。過濾后得到提取液，并將濾渣烘干備用。

1.4 酶解糖化

將150 -190℃水熱預處理60 min后的提取液添加1%的木聚糖酶（質量體積比），50℃水浴酶解30 min。然后置于90℃下滅酶10 min，冷卻，得到酶解液[ll]。

1.5 玉米芯組織結構掃描電鏡分析

采用掃描電子顯微鏡（ SEM）分別對超微粉碎后的玉米芯、水熱預處理后玉米芯和酶解后的玉米芯的微觀結構進行分析，研究不同處理條件下玉米芯組織結構變化。

1.6 玉米芯水熱預處理和酶解糖化組分分析

1.6.1 薄層層析分析層析板為硅膠板，展開劑為乙腈和水（體積比85：15），顯色劑為甲醇和5%硫酸（體積比為95：5）。分別對水熱預處理提取液和酶解糖化液組分進行定性分析[12]。

1.6.2 高效液相色譜分析 色譜柱為Hi-Plex Na（300.0 mmx7.7 mm，ioILm），流動相為水，流速為0.2 ml/min，柱溫78℃。分別對水熱預處理提取液和酶解糖化液組分進行定量分析[13]。

2 結果與分析

2.1 溫度對水熱預處理玉米芯的影響

150℃水熱預處理玉米芯不同時間對還原糖、總糖的影響如圖1所示。隨著時間延長，還原糖的含量變化不明顯，總糖含量先增加再減少最后又增加。在高溫條件下木聚糖脫乙酰形成乙酸，降低了體系的pH，阿拉伯糖的主鏈和側鏈都發生了水解，木聚糖從原來的組織結構中游離出來，聚合度降低，溶解度提高，導致總糖含量增加。

在160℃水熱預處理中，隨著時間的延長，還原糖和總糖的含量均呈現增加的趨勢，其中還原糖含量增加緩慢，總糖含量增加明顯（圖2）。說明延長預處理時間，可以大幅度提高總糖的得率。木聚糖水解生成低聚木糖，低聚木糖的得率大于單糖。

170 ℃水熱預處理中，隨著時間的增加，水解液中還原糖和總糖含量均呈現增加趨勢，并且其含量比160℃水熱預處理的含量高出很多（圖3）。說明增加溫度，有助于纖維素和半纖維素的水解，使水解液中還原糖含量增加。

180 ℃水熱預處理中，隨著處理時間的增加，還原糖、總糖含量呈上升趨勢（圖4）。隨著溫度和處理時間的增加，玉米芯中纖維素、半纖維素和木質素結構遭到破壞[14]，使得水解液中還原糖和總糖含量增加。

190 ℃水熱預處理中，隨著處理時間的延長，還原糖、總糖的含量先上升后下降，在60 min時還原糖、總糖含量達到了最高值（圖5）。在此處理條件下，纖維素，木質素和半纖維素之間的化學鍵斷裂，各自水解成相應的單糖。

2.2 不同溫度水熱預處理下玉米芯的組織結構變化

圖6為超微粉碎玉米芯和水熱預處理不同條件下玉米芯的掃描電鏡圖。未經處理的玉米芯結構完整，組織形態細密，表面光滑;水熱預處理的玉米芯片狀變為卷曲狀，溫度越高卷曲越明顯，原來較為完整致密的玉米芯大塊組織被撕裂成小塊組織，形成了許多微孔，使原料結構疏松。與150 - 170 ℃ 60mm處理相比，180 ℃ 60 min和190℃60 min處理的玉米芯組織變得更為零散，組織結構微細化，存在大量碎片和塊狀組織，組織表面已經由處理前的平面結構變成蜂窩狀結構。因為水熱預處理后玉米芯組織結構受到破壞，表面積與體積比增大，部分結構分解，產生了低聚合度的糖類物質[15]。

2.3 玉米芯水熱預處理提取液及酶解液組分分析

薄層層析分析結果（圖7）和高效液相色譜分析結果（表1）表明，在190℃水熱預處理60 min的提取液中木二糖含量較高，葡萄糖、木二糖、木三糖、木四糖的得率分別為0.001 mg/g、16. 940 mg/g、4.304mg/g、3.164 mg/g;提取液經木聚糖酶酶解后，葡萄糖、木二糖、木三糖、木四糖的得率分別為4. 771mg/g、64.437 mg/g、6.853 mg/g、1.835 mg/g。

3 結論

通過不同溫度下水熱預處理玉米芯后提取液組分糖含量變化分析可知，預處理溫度越高，水解液中還原糖和總糖的含量越高，同一溫度下處理時間的長短也會影響其含量。掃描電子顯微鏡分析結果顯示，未處理的玉米芯原料組織結構為片狀，經過水熱預處理后，組織結構受到破壞，由片狀變為卷曲狀，溫度越高卷曲越明顯;處理后的玉米芯變得疏松多孔，呈蜂窩狀結構。

水熱預處理玉米芯提取液經木聚糖酶酶解后，組分主要含有葡萄糖、木二糖、木三糖、木四糖。水熱預處理的溫度和時間為190℃和60 min時提取液中糖得率較高，其中木二糖的得率最高，為16.940mg/g，此條件下提取液經木聚糖酶酶解后木二糖得率達到64. 437 mg/g。

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