磁性納米顆粒介導(dǎo)的橢圓小球藻轉(zhuǎn)化體系的建立

曹蘇珊 薛靜 陳緒清 王倩楠 張秀海 安賢惠

摘要：旨在利用磁性納米顆粒作為載體構(gòu)建小球藻的新型轉(zhuǎn)化方法，由于納米載體技術(shù)已經(jīng)被成功地應(yīng)用于動(dòng)、植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，其主要優(yōu)勢(shì)是相對(duì)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)更加便捷、高效。本研究首先利用磁性納米顆粒吸附含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因（EGFP）的質(zhì)粒載體pYBA1132，形成納米顆粒-基因復(fù)合物，通過(guò)磁場(chǎng)作用對(duì)橢圓小球藻原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，進(jìn)而觀察EGFP基因在橢圓小球藻中的瞬時(shí)表達(dá)情況。結(jié)果表明，對(duì)橢圓小球藻細(xì)胞進(jìn)行酶解處理并形成半原生質(zhì)體/原生質(zhì)體后，磁性納米顆粒可以介導(dǎo)外源EGFP基因轉(zhuǎn)入小球藻中，并能夠進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，產(chǎn)生綠色熒光。

關(guān)鍵詞：磁性納米顆粒;增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因（EGFP）;轉(zhuǎn)化;瞬時(shí)表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）02-0306-06

Abstract：Using magnetic nanoparticles as carriers， a new transformation method of Chlorella ellipsoidea was constructed. Nanocarrier technology has been successfully applied to genetic transformation of animals and plants， which is more convenient and efficient than traditional transformation technologies. In this study， magnetic nanoparticles were used to absorb plasmid vector pYBA1132 containing enhanced green fluorescent protein gene （EGFP）， and the nanoparticles-gene complexes were formed. In addition， the protoplasts of Chlorella ellipsoidea were transformed by magnetic force， and the transient expression of EGFP in Chlorella ellipsoidea was observed. After the formation of semi-protoplasts/protoplasts in Chlorella ellipsoidea cells by enzymolysis treatment， the magnetic nanoparticles mediated the transfer of exogenous EGFP gene into Chlorella ellipsoidea， and green fluorescence was detected after transient expression.

Key words：magnetic nanoparticles;enhanced green fluorescent protein gene（EGFP）;transformation;transient expression

小球藻（Chlorella）作為單細(xì)胞真核微藻，是一種重要的微藻資源。由于具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、易大規(guī)模培養(yǎng)、可用于生產(chǎn)修飾復(fù)雜蛋白質(zhì)且成本低廉等多重優(yōu)點(diǎn)[1]，小球藻可以作為一種環(huán)境友好型生物反應(yīng)器用于生產(chǎn)活性物質(zhì)，并有望逐漸成為醫(yī)學(xué)、食品、工業(yè)研究等領(lǐng)域的新型模式生物。隨著小球藻轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的不斷深入，目前已經(jīng)有一些成功轉(zhuǎn)化小球藻的報(bào)道，轉(zhuǎn)化方法包括基因槍法[2]、農(nóng)桿菌侵染法[3]、電擊轉(zhuǎn)化法[4]、聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)法[5]等。研究者們將報(bào)告基因或者具有功能性的外源基因轉(zhuǎn)入小球藻，并實(shí)現(xiàn)其表達(dá)[6]。但是以上方法均存在不同的缺點(diǎn)，如操作復(fù)雜、效率低、遺傳穩(wěn)定性差等，從而限制了小球藻作為生物反應(yīng)器的規(guī)模化應(yīng)用。因此，研發(fā)操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高的遺傳轉(zhuǎn)化方法對(duì)于加快小球藻生物反應(yīng)器的有效開(kāi)發(fā)和利用是一條重要的途徑。

近年來(lái)，納米載體相關(guān)技術(shù)作為極具前景的技術(shù)之一而得到快速發(fā)展，已經(jīng)在各領(lǐng)域發(fā)揮出巨大的作用[7]。磁性納米材料由于具有特殊的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，因而可以被用作基因載體，進(jìn)行磁轉(zhuǎn)化[8]，并且可以在一定程度上起到保護(hù)DNA的作用[9]。四氧化三鐵（Fe3O4）磁性納米顆粒是目前應(yīng)用比較廣泛的磁性顆粒，經(jīng)過(guò)聚乙烯亞胺（PEI）修飾的Fe3O4磁性納米顆粒可以攜帶核酸分子在磁場(chǎng)力的作用下進(jìn)行定向移動(dòng)，從而富集在目的細(xì)胞表面，通過(guò)電荷之間的相互作用，在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化。磁轉(zhuǎn)化最初被應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)錄病毒[10]，隨著納米載體技術(shù)的研究日益深入，該技術(shù)因操作簡(jiǎn)單且高效，同時(shí)具有目的基因高效穩(wěn)定表達(dá)、安全無(wú)害、靶向性高等優(yōu)點(diǎn)[11]，被國(guó)內(nèi)外很多研究者用于進(jìn)行體內(nèi)外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，目前已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化大鼠胃組織細(xì)胞、豬呼吸道上皮細(xì)胞及人細(xì)胞等[12]。由于植物細(xì)胞壁的屏障作用，使納米載體介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化研究發(fā)展相對(duì)緩慢。Torney等于2007年利用二氧化硅納米粒子結(jié)合外源基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，首次成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并將該技術(shù)成功應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域[13]。研究者們隨后利用磁性納米基因載體技術(shù)對(duì)擬南芥[14]、水稻[15]等植物進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，并取得了一定成果，從而使納米載體技術(shù)開(kāi)始逐步應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化方面。

橢圓小球藻（Chlorella ellipsoidea）為單細(xì)胞生物，直徑為3～10 μm，利用磁性納米顆粒作為載體轉(zhuǎn)化藻細(xì)胞在理論上是可行的。考慮到小球藻具有堅(jiān)硬、復(fù)雜的細(xì)胞壁，不利于轉(zhuǎn)化的進(jìn)行，因此在利用磁性納米顆粒對(duì)小球藻細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，要部分或完全去除小球藻的細(xì)胞壁[16]以制備半原生質(zhì)體或原生質(zhì)體，從而提高磁性納米顆粒-質(zhì)粒復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的概率，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化效率。本研究用直徑為100 nm的Fe3O4磁性納米顆粒作為載體，介導(dǎo)外源基因?qū)π∏蛟逶|(zhì)體的轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)外源增強(qiáng)型熒光蛋白基因（EGFP）在小球藻中的轉(zhuǎn)化與瞬時(shí)表達(dá)，為進(jìn)一步通過(guò)基因工程技術(shù)深入開(kāi)發(fā)小球藻生物反應(yīng)器提供新思路。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1試驗(yàn)材料橢圓小球藻F962購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，并在固體平板上連續(xù)劃線繼代進(jìn)行純化;質(zhì)粒pYBA1132、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2試劑與儀器磁性納米顆粒CombiMAG-200、磁板購(gòu)自Chemicell公司;配制培養(yǎng)基及溶液所用試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;纖維素酶、半纖維素、果膠酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。熒光顯微鏡為L(zhǎng)eica DM5500 B生物顯微鏡。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件橢圓小球藻培養(yǎng)基為SE+（亞硒酸鹽富集的）培養(yǎng)基，1L培養(yǎng)基的配方如下：1 ml 2.9 ?mmol/L NaNO3、1 ml 0.3 mmol/L K2HPO4 ·3H2O、1 ml 0.3 mmol/L MgSO4·7H2O、1 ml 0.17 mmol/L CaCl2·2H2O、1 ml 1.2 mmol/L KH2PO4、1 ml 0.4 mmol/L NaCl、1 ml 0.09 mmol/L FeCl3·6H2O、1 ml EDTA-Fe（取4.1 ml濃鹽酸，用蒸餾水稀釋至50 ml，配制成1 mol/L HCl，稱(chēng)取0.930 6 g EDTA-Na2溶解至50 ml蒸餾水中，配制成0.1 ?mol/L EDTA-Na2，稱(chēng)取0.901 g FeCl3·6H2O溶于10 ml上述已經(jīng)配制好的1 mol/L HCl中，然后與10 ml已經(jīng)配制好的0.1 mol/L EDTA-Na2混合，加入蒸餾水稀釋至1 L）、1 ml A5溶液[配方為2.86 g/L H3BO3、1.86 g/L MnCl2·4H2O、0.22 g/L ZnSO4·7H2O、0.39 g/L Na2MoO4·2H2O、0.08 g/L CuSO4 ·5H2O、0.05 g/L Co（NO3）·6H2O]、5 g葡萄糖、1 g酵母提取物，pH值為7.0，固體培養(yǎng)基中需要加入1.8%瓊脂。此外，固體平板劃線培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光照度4 000 lx，光照-黑暗周期16 h-8 h;液體搖瓶培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速140 r/min。

1.2.2小球藻原生質(zhì)體的制備挑取固體平板上的單藻落，接種至20 ml SE+培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7d后，以10%的接種量轉(zhuǎn)接至200 ml培養(yǎng)基中，在光照搖床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取200 ml藻液，8 000 r/min離心5 min，小心棄去上清，收集藻體。將藻細(xì)胞用無(wú)菌水洗滌3次，加入25 ml酶解液[含有2%纖維素酶、2%果膠酶、2%半纖維素酶、0.01 ?mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、0.12 mol/L甘露醇，用0.22 μm濾膜無(wú)菌過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用]，使藻細(xì)胞充分懸浮于酶解液中，于30 ℃、140 r/min避光振蕩條件下分別酶解5 h、10 h、20 h、30 h、40 h、50 h后，于8 000 ?r/min離心，棄上清，用0.02 mol/L PBS（含有0.3 mol/L甘露醇）洗滌3次，去除殘留的酶解液，將藻細(xì)胞含量調(diào)整為1 ml 108～109個(gè)，分別在顯微鏡下觀察小球藻原生質(zhì)體/半原生質(zhì)體情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為3次觀察結(jié)果的生物學(xué)重復(fù)平均值，每次重復(fù)至少統(tǒng)計(jì)3個(gè)具有代表性的視野中的原生質(zhì)體數(shù)和半原生質(zhì)體數(shù)。

1.2.3質(zhì)粒的提取如圖1所示，質(zhì)粒pYBA1132含有由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子與胭脂堿合成酶終止子（NOS）構(gòu)成的EGFP報(bào)告基因的表達(dá)框。按照天根生化科技（北京）有限公司的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提質(zhì)粒，提取純度（OD260/280）約為1.8，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

括號(hào)中數(shù)字為酶切位點(diǎn)在序列中的位置（bp）;ori-Rep為質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn);LB、RB分別為載體的左邊界、右邊界;左右邊界中間部分的序列為可以整合至宿主基因組的片段;Kan為卡那霉素抗性基因;MCS為載體的多克隆位點(diǎn);Nos-Ter、Nos-Pro分別為胭脂堿合成酶啟動(dòng)子、終止子。

1.2.4磁性納米顆粒對(duì)質(zhì)粒的吸附性及保護(hù)性分析將磁性納米顆粒CombiMAG-200和質(zhì)粒按照1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20的質(zhì)量梯度比例混勻孵育0.5 h，制備磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物，將所有復(fù)合物中的DNA質(zhì)量固定為2 μg。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳阻滯技術(shù)進(jìn)行分析，以質(zhì)粒作為對(duì)照，電泳結(jié)束后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。在相同條件下，制備復(fù)合物后加入脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）進(jìn)行酶切消化，將消化后的產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察，以未酶切的復(fù)合物作為對(duì)照。

1.2.5磁性納米顆粒介導(dǎo)的小球藻轉(zhuǎn)化將磁性納米顆粒CombiMAG-200和質(zhì)粒pYBA1132按照1∶2、1∶5、1∶10的質(zhì)量比混勻，在室溫條件下孵育0.5 h，制備磁珠-質(zhì)粒復(fù)合物。在無(wú)菌操作臺(tái)上，將24孔板置于磁板上，加入外加磁場(chǎng)，分別在不同孔中加入300 μl經(jīng)酶解處理的小球藻液與由不同質(zhì)量比例磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物組成的混合液，用槍頭輕輕吹打幾次，混合均勻后進(jìn)行共培養(yǎng)。在磁場(chǎng)作用下，帶有磁性的納米顆粒攜帶質(zhì)粒按照特定方向富集于細(xì)胞上，磁轉(zhuǎn)化2 h后撤去磁場(chǎng)，取出藻細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6熒光顯微觀察磁轉(zhuǎn)化處理后的48 h內(nèi)進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。用接種環(huán)蘸取微量藻液置于載玻片上，用清水稀釋后，蓋上蓋玻片。首先用熒光顯微鏡在明場(chǎng)下尋找到小球藻視野，再用激發(fā)光觀察EGFP基因在小球藻中的瞬時(shí)表達(dá)情況。

2結(jié)果與分析

2.1小球藻酶解及酶解時(shí)長(zhǎng)對(duì)半原生質(zhì)體/原生質(zhì)體生成的影響

由于小球藻細(xì)胞壁成分復(fù)雜、細(xì)胞壁較厚，并且不同小球藻種之間細(xì)胞壁差異較大，因此制作小球藻原生質(zhì)體及半原生質(zhì)體是轉(zhuǎn)化體系中較為關(guān)鍵的一步。由于單一酶解液的效果并不理想，因此采用組合酶液對(duì)小球藻進(jìn)行酶解處理。

取酶解不同時(shí)間的藻細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。通過(guò)研究不同酶解時(shí)間對(duì)半原生質(zhì)體/原生質(zhì)體形成的影響發(fā)現(xiàn)：酶解時(shí)間不足，形成半原生質(zhì)體/原生質(zhì)體的數(shù)量較少;酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞酶解過(guò)度，又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物溢出，無(wú)法形成完整細(xì)胞。綜合分析，最佳酶解條件為在避光條件下于30 ℃、140 r/min酶解30 h，相應(yīng)的原生質(zhì)體/半原生質(zhì)體形成率為55.7%（圖2）。

2.2磁性納米顆粒對(duì)質(zhì)粒的吸附性

DNA小分子可以穿過(guò)瓊脂糖凝膠，向電場(chǎng)正極方向遷移而形成條帶。磁性納米顆粒通過(guò)靜電吸附作用與質(zhì)粒相互結(jié)合形成磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物，將大量質(zhì)粒吸附于磁性納米顆粒上后，由于復(fù)合物的粒徑相對(duì)較大，進(jìn)行電泳時(shí)復(fù)合物會(huì)被阻滯于點(diǎn)樣孔中而不隨之遷移。當(dāng)磁性納米顆粒對(duì)質(zhì)粒的吸附達(dá)到飽和以后，未被吸附的質(zhì)粒則會(huì)在凝膠中進(jìn)行遷移，因此對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行觀察分析便可以判斷磁性納米顆粒對(duì)質(zhì)粒的吸附性能。圖3的電泳結(jié)果顯示，不同質(zhì)量比梯度的磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物的結(jié)合能力不同，其中1～4泳道的質(zhì)粒基本未遷移出點(diǎn)樣孔，5泳道中有部分質(zhì)粒開(kāi)始遷移，表明磁性納米顆粒與質(zhì)粒的質(zhì)量比為1∶1、1∶2、1∶5、1∶10時(shí)均可穩(wěn)定結(jié)合，當(dāng)質(zhì)量比達(dá)到1∶20時(shí)，磁性納米顆粒的吸附能力已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)。

2.3磁性納米顆粒對(duì)質(zhì)粒的保護(hù)性

外源基因在磁性納米顆粒的攜帶下進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)部酶的消化作用可能導(dǎo)致DNA降解。而磁性納米顆粒與質(zhì)粒由于靜電吸附作用形成的復(fù)合物緊密結(jié)合，產(chǎn)生了構(gòu)象上的變化，可以在一定程度上保護(hù)DNA。因此，通過(guò)分析磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物能否免受酶解消化作用，能夠檢測(cè)復(fù)合物在進(jìn)入細(xì)胞后對(duì)外源核酸的保護(hù)作用。制備磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物之后，用DNase Ⅰ進(jìn)行消化，以同樣條件下未加入DNase Ⅰ的磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物作為對(duì)照，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果顯示，磁性納米顆粒在與質(zhì)粒的質(zhì)量比為1∶10及以?xún)?nèi)時(shí)均停留在點(diǎn)樣孔中，未被消化，與未加入DNase Ⅰ的復(fù)合物基本一致，磁性納米顆粒呈現(xiàn)出良好的結(jié)合性和保護(hù)性;而當(dāng)磁性納米顆粒與質(zhì)粒的質(zhì)量比為1∶20時(shí)，由于結(jié)合達(dá)到飽和，質(zhì)粒并未完全與磁性納米顆粒結(jié)合而被降解;經(jīng)過(guò)酶處理的純質(zhì)粒完全被降解（圖4）。結(jié)果表明，在磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物中，磁性納米顆粒可以與外源基因結(jié)合，從而有效保護(hù)DNA免受核酸酶的降解。

1、3、5、7、9泳道為未經(jīng)酶切的磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物，磁性納米顆粒與質(zhì)粒的質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20;2、4、6、8、10泳道為相同條件下經(jīng)過(guò)酶切的磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物產(chǎn)物，磁性納米顆粒與質(zhì)粒的質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20;11泳道為未經(jīng)酶切的質(zhì)粒;12泳道為經(jīng)過(guò)酶切的質(zhì)粒。每孔中的DNA質(zhì)量均為2 μg。

2.4磁性納米顆粒-DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)化小球藻的熒光瞬時(shí)表達(dá)

用納米磁性顆粒介導(dǎo)EGFP基因轉(zhuǎn)化小球藻細(xì)胞后，48 h內(nèi)進(jìn)行熒光顯微觀察。圖5顯示，經(jīng)質(zhì)粒pYBA1132轉(zhuǎn)化的藻細(xì)胞中部分發(fā)出綠色熒光，在視野中呈清晰的綠色，未被轉(zhuǎn)化的藻細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，表明綠色熒光蛋白基因EGFP被成功轉(zhuǎn)入橢圓小球藻F962中并表達(dá)出熒光蛋白。試驗(yàn)結(jié)果表明，由磁性納米顆粒介導(dǎo)的小球藻遺傳轉(zhuǎn)化方法是成功的。

3討論

遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建是開(kāi)展基因工程研究工作的基礎(chǔ)，而新型、高效的納米載體技術(shù)的出現(xiàn)，加快了植物基因工程的研發(fā)速度。當(dāng)前，已有研究將該技術(shù)應(yīng)用于棉花[17]、水稻[15]等作物上，通過(guò)便捷穩(wěn)定的操作，簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)化過(guò)程中一系列繁瑣的步驟，而且在遺傳轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，受體材料的可選擇范圍廣，磁性納米顆粒對(duì)受體材料呈現(xiàn)出優(yōu)良的安全性、穩(wěn)定性與保護(hù)性。本研究首次嘗試將磁性納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法用于小球藻，小球藻作為當(dāng)前最具經(jīng)濟(jì)潛力和生產(chǎn)價(jià)值的真核微藻之一[18]，其應(yīng)用范圍廣泛，可作為轉(zhuǎn)基因技術(shù)良好的受體材料，但是由于其遺傳轉(zhuǎn)化方法的限制等原因，導(dǎo)致小球藻的基因工程工作進(jìn)展緩慢。納米載體具有獨(dú)特的理化結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)化原理，可以簡(jiǎn)化傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法的操作步驟，裝載大量核酸分子，并且在一定程度上保護(hù)與之結(jié)合的外源基因，從而提高轉(zhuǎn)化效率。本研究結(jié)果表明，磁性納米顆粒與質(zhì)粒的質(zhì)量比在1∶10及以?xún)?nèi)時(shí)均可以穩(wěn)定結(jié)合且DNA不容易被DNase Ⅰ消化降解，這是外源基因有效進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。

植物細(xì)胞具有堅(jiān)實(shí)的細(xì)胞壁，小球藻的細(xì)胞壁是磁性納米顆粒-質(zhì)粒復(fù)合物進(jìn)入受體細(xì)胞的障礙之一，因此利用酶解法去除小球藻細(xì)胞壁是轉(zhuǎn)化過(guò)程中的第一步。小球藻細(xì)胞壁成分復(fù)雜，主要成分為纖維素和半纖維素[19]，本試驗(yàn)使用混合酶解液制備小球藻半原生質(zhì)體/原生質(zhì)體，纖維素酶和半纖維素酶可以有效疏松其細(xì)胞壁，提高轉(zhuǎn)化效果，并且對(duì)細(xì)胞的整體傷害小。酶解時(shí)間的選擇是其中關(guān)鍵的一步，酶解時(shí)間過(guò)短，半原生質(zhì)體/原生質(zhì)體獲得率較低;而酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)容物流出，導(dǎo)致細(xì)胞不完整，無(wú)法作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行高效遺傳轉(zhuǎn)化。本試驗(yàn)探究了酶解時(shí)間對(duì)橢圓小球藻F962半原生質(zhì)體/原生質(zhì)體形成的影響，最終確定了橢圓小球藻在30 ℃、140 r/min條件下避光酶解30 h時(shí)，獲取半原生質(zhì)體/原生質(zhì)體的效果最佳。

本研究在轉(zhuǎn)化過(guò)程中使用增強(qiáng)型熒光蛋白基因作為外源報(bào)告基因，EGFP基因?yàn)镚FP基因的突變型，發(fā)射的熒光強(qiáng)度比GFP基因增加了約35倍[20]，且已有報(bào)道表明該基因已經(jīng)成功在杜氏鹽藻（Dunaliella salina）中表達(dá)[21]。在本研究中，EGFP基因在小球藻中的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果清晰，因此更適合作為一種報(bào)告基因在小球藻中用于檢測(cè)基因的瞬時(shí)表達(dá)情況。通過(guò)EGFP基因瞬時(shí)表達(dá)建立磁性納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法作為構(gòu)建生物新型遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步探索，證明了此方法用作小球藻轉(zhuǎn)化技術(shù)的可行性。

利用小球藻作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)功能蛋白質(zhì)正在不斷發(fā)展，雖然目前小球藻已經(jīng)成功表達(dá)人生長(zhǎng)素[22]、比目魚(yú)生長(zhǎng)激素[23]、兔防御素[24]等具有功能性的外源蛋白質(zhì)，但是由于轉(zhuǎn)化體系與方法不穩(wěn)定等原因，限制了小球藻作為生物反應(yīng)器的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。因此，不斷發(fā)展便捷穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)對(duì)于小球藻的開(kāi)發(fā)利用尤為重要。磁性納米顆粒作為載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，已經(jīng)被證明可以用于小球藻的轉(zhuǎn)化，相對(duì)于其他轉(zhuǎn)化方法具有可以裝載大量大片段DNA與操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，具有一定的優(yōu)越性。后續(xù)還需不斷優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，建立更加穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為發(fā)展小球藻新型轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：徐艷）