基于GC-MS 指紋圖譜和多元統計學區分四川保寧醋和山西老陳醋的揮發性差異代謝產物

鄺格靈，李 樹，寧甜甜，趙國忠*

（省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

世界大部分國家都將醋作為酸性調味品，醋的生產和消費在中國已有3 000多年的歷史，每個地區都有自己的地方醋。山西老陳醋是中國著名的傳統食醋之一，由高粱、豌豆、麥麩、谷糠和稻殼經多種真菌和細菌開放式固態發酵而成，已有近3 000年的歷史，被選為國家非物質文化遺產[1]。四川保寧醋，起源于1618年的閬中市，是四川最著名的麩皮醋，是以生麥麩、蒸高粱或糯米為主要原料，通過增加中國傳統草藥，如杜仲、砂仁、甘草等發酵而成[2]。由于原料基礎不同、加工工藝不同、參與發酵的優勢微生物群落不同，造成它們在品質風格上存在一定差異。醋的香氣成分對醋的品質起著至關重要的作用。對醋的香氣進行表征和鑒定，將有助于解釋不同產品之間的差異[3]。

氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術是一種穩健的代謝組學工具[4]，是目前應用最廣泛的食品揮發物分析技術和方法之一[5]。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種無監督的多元變量統計分析方法，是在多元分析中使用最多的工具[6]。它使用少量的綜合變量（主成分）取代原先的復雜多變量，從而能在最大程度保留數據原有信息的情況下，降低數據復雜度，并對數據進行可視化處理[7]。而正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）是一種有監督的多元統計方法，用以加強PCA中已經建立的觀察組之間的弱分離，從而更好地區分兩組之間的差異[8]。它不僅能實現樣品差異的鑒別，還能獲得樣品差異的特征標記物，有利于對樣品不同產地、不同部位、不同加工方式等的快速鑒別[9]。

本研究采集四川保寧醋6 份，山西老陳醋9 份，以此為研究對象，采用GC-MS指紋圖譜對其揮發性成分進行分析，并結合PCA和OPLS-DA等多變量統計分析方法探討對山西老陳醋和四川保寧醋的差異貢獻最大的潛在標志物。本實驗擬為進一步分析不同食醋的質量和風格特色的形成提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原料購自當地超市及網上專賣店，樣品常溫保存。S1～S6為四川保寧醋，S7～S15為山西老陳醋。樣品信息見表1。

2-辛醇（色譜純） 美國Alfa Aesar公司；C6～C25正構烷烴 美國AccuStandard公司；其他化學試劑都為國產分析純。

表1 樣品信息Table 1 Information about the vinegar samples used in this study

1.2 儀器與設備

GC-MS聯用儀 日本島津公司；75 μm CAR/PDMS萃取頭、頂空瓶 上海安譜實驗科技股份有限公司；磁力攪拌器 德國IKA公司；ME3002E電子分析天平美國梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

用蒸餾水將樣品稀釋10 倍，吸取6 mL于15 mL頂空瓶中，加入1.5 g氯化鈉和30 μL 2-辛醇（0.125 mg/L的2-辛醇-甲醇溶液），并加轉子，聚四氟乙烯封口，于50 ℃、600 r/min磁力攪拌器水浴平衡10 min，然后插入75 μm CAR/PDMS萃取頭（使用前按說明進行老化）頂空吸附40 min，吸附結束拔出萃取頭，迅速插入GC-MS進樣口中，于250 ℃解吸5 min，同時啟動儀器采集數據。

1.3.2 GC-MS條件

GC條件：Rtx-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升溫至150 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min升溫至250 ℃；進樣口溫度250 ℃；載氣為氦氣，純度99.999%，流速1 mL/min；進行方式：手動；進樣模式：分流進樣，分流比為10∶1。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；傳輸線溫度220 ℃；溶劑延遲時間1.5 min；質量掃描范圍m/z35～500；掃描模式為全掃描。

1.4 數據處理

定性和定量分析：采用正構烷烴的標準溶液，利用Rtx-5MS計算每種物質的相對保留指數，并對比文獻資料中Rtx-5MS色譜柱下每種物質的相對保留指數，同時結合標準譜庫NIST11和Wiley準確鑒定15 個樣品的揮發性成分。同時采用內標法進行半定量，得到各組分的相對含量。利用SIMCA-P+14.1軟件，采用PCA方法對保寧醋和山西醋的質量穩定性和一致性進行了評價，同時基于OPLS-DA找出潛在標志性差異性化合物。

2 結果與分析

2.1 四川保寧醋和山西老陳醋揮發性風味物質測定結果

表2 樣品的揮發性成分及其相對含量Table 2 Types and relative amounts of volatile components of vinegar simples

經SPME-GC-MS分離和鑒定，6 種四川保寧醋分別鑒定出89、86、94、90、98、102 種化合物，其中在6 種保寧醋中均檢測到的化合物有26 種，作為四川保寧醋的特征風味物質；9 種山西老陳醋分別鑒定出91、89、106、110、87、71、94、96、86 種化合物，9 種山西老陳醋中8 種以上檢測到的物質有27 種，視為山西老陳醋的特征風味物質。將兩者各自的特征物質結合在一起，共得到35 種物質，包括醇、醛、酸、酯、酚、酮以及雜環化合物，見表2。序號1～8為四川保寧醋特有特征物質，序號9～25為四川保寧醋和山西醋的共有特征物質，序號26～35為山西醋特征物質。以此為指標通過PCA和OPLS-DA等多元統計學方法分析四川保寧醋和山西老陳醋的揮發性差異代謝產物。

2.2 四川保寧醋和山西老陳醋的代謝組學差異分析

2.2.1 PCA結果

圖1 2 種食醋揮發性風味組分PCA的分數散點圖Fig. 1 Score scatter plot based on PCA model for volatile flavor components in two vinegars

利用2 種食醋的香氣組分的相對含量進行PCA，提取得到2 個主成分，累計貢獻率為65.03%，基本可以表征所涉及的化學成分信息。從圖1可以看出，在95%置信區間內，2 組樣本具有明顯的區域分布特征且表現出聚類趨勢，但組間樣品點比較散。

2.2.2 OPLS-DA結果

圖2 2 種食醋揮發性風味組分OPLS-DA得分散點圖Fig. 2 Score scatter plot based on OPLS-DA model for volatile flavor components in two vinegars

PCA雖然能反映出四川保寧醋和山西老陳醋的明顯差異，但其僅反映了數據的原始狀態，忽略了數據間的整體性特征與變化規律，不利于尋找組間差異代謝物[10]。為更好地觀察四川保寧醋和山西老陳醋揮發性成分的差異和特征，找到能夠標記差異的信號分子，從而篩選出差異形成的潛在標記物，采用有監督的OPLS-DA的模式識別方法對2 種四大名醋樣品數據進行了建模分析。OPLS-DA參數R2X描述了X變量中有多少變化可以用所選的組件解釋。R2描述了模型的擬合程度。Q2表示X對Y的預測能力，R2和Q2的取值范圍為0～1，其中1表示完全適合度和預測能力[11]。由圖2可知，2 組樣本在OPLS-DA得分圖上聚類良好，顯著分離（=0.615，R2=0.903，Q2=0.822）。為0.615，表明所選組件可以對數據集中61.5%的變化進行建模，又因為R2和Q2參數數值接近1，所以OP LS-DA模型的可解釋度和模型擬合很好。與無監督的PCA得分散點圖相比，山西老陳醋和四川保寧醋樣本有了最大程度的分離，且降低了樣品的組內差異，這樣便于更準確地尋找兩者的化學差異成分。

2.2.3 OPLS-DA模型評價

OPLS-DA是一種有監督的多元統計方法，有監督的分類模型缺點是可能會出現過擬合現象，即模型可以很好地將樣本進行區分，但用來預測新的樣本集時卻表現很差。因此采用SIMCA-P軟件對建立的OPLS-DA模型進行置換檢驗和交叉驗證方差分析驗證模型的可靠性。

圖3 2 種食醋樣品OPLS-DA置換檢驗結果圖Fig. 3 OPLS-DA replacement test results for two vinegars

當原始數據中沒有添加額外的數據或噪聲，置換檢驗更有助于進行模型的驗證[12]。其通過隨機改變分類變量Y的排列順序，多次建立對應的OPLS-DA模型以獲取隨機模型的R2和Q2值，在避免檢驗模型的過擬合以及評估模型的統計顯著性上具有重要作用。如圖3所示，橫坐標表示置換檢驗的置換保留度（置換保留度等于1處的點即為原模型的R2和Q2值），所有R2點從左到右均低于最右的原始的R2點，所有Q2點均低于右側的原始Q2點，且點的回歸線與橫坐標交叉或者小于0，一般認為Q2為負值，這說明統計模型是有效的，沒有過擬合[13]。另外，將OPLS-DA模型進行交叉驗證方差分析，結果顯示P值為9.15×10－4，也小于0.05，具有統計學意義，這進一步表明模型穩定可靠[14]。

2.2.4 潛在差異標志物

為進一步找出對結果分型起貢獻作用的變量，得到了OPLS-DA模型的S-plot和VIP圖如圖4、5所示。S-plot最初是由Wiklund等首次用來鑒定2 個樣本之間的化學差異，它顯示了代謝物和模型類指定之間的協方差和相關性，是將多元分類模型可視化和解釋的工具[15]。因此，S-plot圖有助于根據對模型的貢獻及其可靠性，能夠識別具有統計意義和潛在生物化學意義的代謝物[16]。“S”兩端的點表示潛在的化學標記，具有較高的置信度，即對分型貢獻較小的變量會聚集在原點附近，而對分型貢獻較大的變量則分散在“S”型的兩端[17]。變異權重參數值（variable importance in projection，VIP）的大小反映了每個品質成分對模型貢獻率的大小，值越大貢獻越大[18]。以VIP值大于1為界限進行篩選并結合S-plot圖可以看出，糠醛、乙酸乙酯、2,4-二叔丁基酚、醋酸、乙酸苯乙酯和苯乙醇這6 種風味物質是對2 種四大名醋差異貢獻最大的潛在標志物。

圖4 基于OPLS-DA模型分析的S型載荷圖Fig. 4 S-plot based on OPLS-DA model an alysis

圖5 基于OPLS-DA模型分析的VIP預測值分布圖Fig. 5 Distribution of VIP forecast values based on OPLS-DA model analysis

2.2.5 差異性成分在四川保寧醋和山西老陳醋相對含量分析

對獲得的6 個差異性較大的揮發性變量在四川保寧醋和山西老陳醋的相對含量進行熱圖分析，如圖6所示，糠醛、2,4-二叔丁基酚在四川保寧醋中的相對含量比在山西老陳醋中的相對含量高，苯乙醇在四川保寧醋中未檢測到或含量很低。而醋酸、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯在山西老陳醋中的相對含量遠高于其在四川保寧醋中的相對含量。

糠醛又稱呋喃甲醛或麩醛，有助于杏仁、烤土豆、面包、燒焦味[19]，主要是由戊聚糖分解或酵母發酵所產生[20]。苯乙醇具有蜂蜜香和玫瑰香，是酵母菌的代謝產物，來源于乙醇發酵過程中苯丙氨酸的降解[21]。乙酸乙酯具有果香、酒香，是酵母細胞質中 糖酵解產生的乙醇或乙酸與線粒體呼吸產生的乙酰輔酶A發生酯化反應生成的[22]。乙酸苯乙酯具有蜜甜香，少量產生于乙醇發酵階段，大量產生于醋酸發酵階段，由苯乙醇在酯酶的作用下合成[23]。但目前關于2,4-二叔丁基酚的風味及來源還不清楚，發現2,4-二叔丁基酚在酒、醋、茶[24]中被廣泛檢測到，尤其是藥酒、藥醋，比如懷山藥[25]、葛根酒[26]等。此外，2,4-二叔丁基酚還能在中草藥中被檢測出，比如沉香[27]、姜黃[28]、香草蘭[29]、三角梅[30]等。所以，可以猜測保寧醋中高含量的2,4-二叔丁基酚與加 入的中草藥有關。

圖6 差異代謝物的熱圖分析Fig. 6 Heatmap of differen t metabolites

3 結 論

本研究基于GC-MS指紋圖譜對6 種四川保寧醋和9 種山西老陳醋揮發性風味物質進行測定，四川保寧醋得到26 種共有物質，山西老陳醋得到27 種共有物質，將兩者各自的共有物質結合共得到35 種物質。以這35 種物質為研究對象，結合PCA和OPLS-DA多元數據變量進行統計分析，結果顯示：山西老陳醋和四川保寧醋樣本在散點圖上分離良好；以VIP值大于1為界限進行篩選并結合S-plot圖共得到6 種差異代謝物，分別為糠醛、乙酸乙酯、2,4-二叔丁基酚、醋酸、乙酸苯乙酯和苯乙醇；通過熱圖對差異性代謝物分析，可以發現糠醛、2,4-二叔丁基酚在四川保寧醋中的相對含量比在山西老陳醋中高，而醋酸、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯在山西老陳醋中的相對含量遠高于其在四川保寧醋中的相對含量，另外，苯乙醇在四川保寧醋中的未檢測到或含量很低。這為食醋行業質量評價提供參考數據，為進一步研究和分析不同食醋的質量和風格特色的形成提供了新的思路和方法。