西紅花苷對子宮腺肌病異位子宮內膜間質細胞生長周期的影響及機制研究

周江妍　宋曉園　徐黎賢

[摘要] 目的 研究西紅花苷對子宮腺肌病異位子宮內膜間質細胞生長周期及凋亡的影響，從細胞水平初步探討西紅花苷在子宮腺肌病中的治療作用。 方法 2018年1～6月收集江西省婦幼保健院術后病理確診為子宮腺肌病標本，不同濃度西紅花苷（0、200、300、400、500 μg/mL）作用于異位子宮內膜間質細胞后，分別在培養0、24、48、72、96 h取出，CCK-8法檢測細胞增殖; Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡;PI單染檢測細胞周期。 結果 CCK-8法檢測西紅花苷濃度分別為200、300、400、500 μg/mL作用細胞72 h后，細胞抑制率分別為（7.60±0.03）%、（11.50±0.10）%、（18.26±0.14）%、（20.62±0.09）%，濃度為400 μg/mL、500 μg/mL組增殖抑制率明顯高于濃度為200 μg/mL組，結果顯示不同濃度西紅花苷對子宮腺肌病異位內膜細胞增殖有明顯抑制作用，與藥物濃度及時間呈正比，隨著西紅花苷濃度的升高和作用時間的延長，對細胞增殖的抑制率也越高;不同濃度西紅花苷作用細胞48 h后，流式細胞術檢測到子宮腺肌病異位子宮內膜間質細胞凋亡率隨濃度的增加而增大，細胞周期G0/G1期比例增多。 結論 西紅花苷在體外能顯著抑制子宮腺肌病異位子宮內膜間質細胞增殖，誘導凋亡，使細胞周期阻滯在G0/G1期，這些結果在細胞水平上顯示西紅花苷可用于臨床治療子宮腺肌病。

[關鍵詞] 子宮腺肌病;間質細胞;西紅花苷;細胞增殖;凋亡

[中圖分類號] R711.7 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）23-0045-05

Impacts and mechanism study of crocin on the growth cycle of ectopic endometrial stromal cells in adenomyosis

ZHOU Jiangyan1 ? SONG Xiaoyuan2 ? ?XU ?Lixian1

1.Department of Gynecology， Jiangxi Maternal and Child Health Hospital， Nanchang ? 330006， China; 2.Department of Chemical Medicine， Ganzhou Institutes for Food and Drug Control in Jiangxi Province， Ganzhou ? 341000， China

[Abstract] Objective To explore the impact of crocin on the growth cycle and apoptosis of ectopic endometrial stromal cells in adenomyosis， and to preliminarily investigate the therapeutic effect of crocin on adenomyosis from cells level. Methods From January to June 2018， specimens of adenomyosis confirmed by postoperative pathology in Jiangxi Maternal and Child Health Hospital were collected. After crocin （0， 200， 300， 400， 500 μg/mL） of different concentrations performed on ectopic endometrial stromal cells， they were taken out after 0，24，48，72，96 hours of culture respectively，and cell proliferation was detected by CCK-8 method. Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry was used to detect cell apoptosis. PI single staining was used to detect cell cycle. Results The cell inhibition rates were（7.60±0.03）%， （11.50±0.10）%， （18.26±0.14）%， （20.62±0.09）%， respectively after different concentrations of crocin of 200， 300， 400， 500 μg/mL applied to the cells for 72 h detected by the CCK-8 method. The proliferation inhibition rate of 400 μg/mL、500 μg/mL were significantly higher than that of the 200 μg/mL group. The results showed that crocin of different concentrations had obvious inhibition effect on the proliferation of ectopic endometrial cells of adenomyosis，which was proportional to the drug concentration and time. The higher of crocin concentration and the longer of acting time， the higher of the cell proliferation inhibition rate. 48 hours after crocin at different concentrations acted on cells， flow cytometry detected that with the increase of concentration， the apoptosis rate of ectopic endometrial stromal cells in adenomyosis increased and the G0/G1 phase ratio of cell cycle increased. Conclusion Crocin can significantly inhibit proliferation of ectopic endometrial stromal cells of adenomyosis in vitro， induce apoptosis， lead cell cycle to G0/G1 phase， suggesting from cell levels that crocin can be used for clinical treatment of adenomyosis.

[Key words] Adenomyosis; Stromal cells; Crocin; Cell proliferation; Apoptosis

子宮腺肌病是子宮內膜腺體和間質細胞向肌層浸潤并彌漫性生長的良性疾病，其發病率有逐漸增高的趨勢，已成為人們日益重視的婦科難治癥之一[1]。目前其病因尚不明確，發病機制復雜，臨床表現為痛經進行性加重、子宮增大、月經量過多、經期延長等，嚴重影響廣大婦女的生活質量及身心健康[2-4]。在治療上西醫包括藥物治療、手術及介入治療，除子宮全切術的根除性手術治療外，其他方法治療后的療效不甚滿意，且復發率高，副作用大，患者難以接受。子宮腺肌病屬中醫的“痛經”、“癥瘕”等范疇，而中醫藥在治療痛經、癥瘕等方面有顯著的優勢和特色，不需手術且副作用小，患者容易接受。西紅花苷是活血化瘀中藥，具有疏經活絡、通經化淤、散郁開結、消腫止痛的功效，常用于婦科治療[5]。西紅花苷是西紅花中分離的有效單體成分之一，具有抗腫瘤活性，能高度抑制多種腫瘤細胞的生長，而不影響正常細胞的生長繁殖，在抗腫瘤的藥理作用上可能是多靶點多途徑的，如誘導癌細胞凋亡，抑制惡性增殖，影響細胞周期及分化、抑制炎性因子表達，控制多藥耐藥性等[6，7]。目前還沒有西紅花苷對子宮腺肌病影響的研究報道，本文旨在細胞水平上探索西紅花苷對子宮腺肌病的作用，為臨床治療子宮腺肌病提供理論基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 組織標本 ?2018年1～6月收集江西省婦幼保健院術后病理確診為子宮腺肌病標本5份，患者年齡35～50歲，月經規律。入選標準：術前6個月內未接受任何激素治療;術前6個月內無妊娠及哺乳史;無甲亢、甲減等代謝性疾病;無高血壓、糖尿病、心臟病等慢性疾病;近2周未服用激素類藥物。排除標準：絕經、急、慢性炎癥性疾病，合并卵巢子宮內膜異位囊腫、免疫系統疾病及吸煙患者除外[8]。所有入選的患者遵循自愿原則并簽署知情同意書。本實驗符合赫爾辛基原則，經我院倫理委員會批準。

1.1.2 實驗藥物 ?西紅花苷由贛州市食品藥品檢驗檢測中心提供，批號為17304。配制西紅花苷母液：稱取藥物粉末1 g，溶于10 mL PBS中，規格為0.22 μm濾器過濾除菌，獲得濃度為10 mg/mL的母液，分裝備用。

1.1.3 所需試劑 ?DMEM/F-12培養基、胎牛血清、含EDTA的胰酶等細胞培養用品均為Hyclone公司產品;CCK-8試劑盒、凋亡及周期檢測試劑盒均來自上海貝博生物。

1.1.4 所用儀器 ?細胞培養箱（2046-II，美國），酶標儀（iMark，美國），流式細胞測定儀（FC500，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離培養及鑒定 ?子宮腺肌病灶組織收集后，立即置冰上，30 min內到超凈臺，參照文獻[9]分離、純化培養異位子宮內膜間質細胞，經消化、過濾、差速貼壁培養、免疫細胞化學鑒定為子宮內膜間質細胞。將（11.50±0.10）含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養基中，放于細胞培養箱中正常培養。后續取對數期生長的細胞用于功能實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 ?0.25% EDTA-胰蛋白酶消化細胞，調整單細胞密度為1×103個/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，邊緣孔用PBS填充，每個處理組做5個重復。放入細胞培養箱培養24 h。實驗分為5組，各組加入藥物西紅花苷的終濃度為0、200、300、400、500 μg/mL。西紅花苷0 μg/mL組為不加藥物的正常對照組。設置5個復孔，分別在培養0、24、48、72、96 h的時間點取出，按檢測試劑盒說明書操作，酶標儀上測定每孔OD值。實驗重復三次。細胞增殖抑制率（%）=[1-（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（西紅花苷0 μg/mL組OD值-空白對照組OD值）]×100%。

1.2.3 PI-AnnexinⅤ-FITC標記流式細胞法檢測細胞凋亡 ?將指數期生長的細胞胰酶消化，離心，重懸后種于6孔板。在細胞鋪滿皿底90%左右時加入西紅花苷溶液。實驗分為5組，各組加入藥物西紅花苷的終濃度為0、200、300、400、500 μg/mL。48 h后，PBS洗滌，用不含EDTA胰酶消化細胞，離心，PBS洗滌2次后，按細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作處理，依次加入染液及緩沖液，混勻，避光孵育10 min后，流式細胞儀檢測，CXP軟件分析結果。

1.2.4 PI標記流式細胞法檢測細胞周期 ?將指數期生長的細胞胰酶消化，離心，重懸后種于6 cm培養皿。在細胞鋪滿皿底80%左右時加入西紅花苷溶液。實驗分為5組，各組加入藥物西紅花苷的終濃度為0、200、300、400、500 μg/mL。48 h后，用0.25%的胰酶消化制成單細胞懸液，1000 r/min離心棄上清，1 mL PBS重懸細胞，再加10 μL Rase A，37°C水浴30 min后PBS洗滌2次，再加入50 μg/mL PI染色液500 μL，4°C下避光染色30 min后上機測試，采用周期分析軟件分析細胞周期。

1.3 統計學方法

采用SPSS22.0統計軟件，各組間采用one-way ANOVA 進行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 異位子宮內膜間質細胞原代培養及鑒定

經消化、過濾、差速貼壁培養的子宮內膜細胞，光學顯微鏡下用鼠抗人vimenin抗體鑒定呈棕色，cytokeratine抗體鑒定不呈色為間質細胞，純度達95%以上（封三圖8）。

2.2 西紅花苷對子宮內膜間質細胞增殖作用的影響

CCK-8檢測結果顯示西紅花苷對子宮腺肌病異位子宮內膜間質細胞增殖有明顯抑制作用，與藥物濃度及時間呈正比，隨著西紅花苷濃度的升高和作用時間的延長，對細胞增殖的抑制率也越高。從結果可以看到，濃度為400、500 μg/mL組處理細胞72 h后，增殖抑制率明顯高于濃度為200 μg/mL組。見表1。

2.3 西紅花苷誘導細胞凋亡

FITC-An-nexin V/PI雙染色流式細胞術檢測不同濃度西紅花苷對細胞有不同程度的誘導凋亡作用，隨著西紅花苷濃度的增加，誘導細胞凋亡的作用越大。從結果可以看出，西紅花苷濃度為200、300、400、500 μg/mL組分別處理細胞48 h后，細胞凋亡率依次為8.6%、20.7%、31.5%、40.9%，與西紅花苷 0 μg/mL組（1.9%）相比有顯著差異。見圖1。

2.4 西紅花苷對細胞周期影響

不同濃度的西紅花苷作用子宮內膜間質細胞48 h后，PI染色檢測細胞周期，結果顯示：與對照組相比，隨著藥物濃度的升高，G0/G1期細胞所占比例逐漸增加，細胞周期被阻滯在G0/G1期。見圖2。

3 討論

子宮腺肌病雖是良性疾病，主要特征是子宮內膜在子宮肌層種植生長、浸潤、反復出血。但具有侵襲性生長、遠處轉移等類似惡性腫瘤的生物學特性，臨床上對子宮腺肌病的治療目的在于縮減病灶，控制疼痛，促進生育，減少復發[10]，目前尚無有效的保守治療方法。經確診后多采用激素類藥物或手術治療，但激素治療副作用大，停藥后復發，而手術治療多有一定的適應證，且保守性手術復發率都較高，常需切除子宮，創傷大，患者難以接受，二者均有一定的局限性。目前如何抑制子宮腺肌病灶的增長及轉移是臨床治療的難點。子宮腺肌病發病機制仍不十分清楚，現多認為子宮腺肌病可能是一種多因素疾病，涉及相關學說很多，如經血逆流學說[11]、體腔上皮化生學說[12]，但單一的學說均不能完全解釋清楚。子宮腺肌病的實質是具有生物活性的子宮內膜侵入肌層，因此內膜細胞的特殊的生物學功能可能是腺肌病發生的機制之一。異位內膜細胞粘附及侵襲能力增強[13，14]，增殖與凋亡異常[15，16]，免疫及相關炎癥因素等可能參與子宮腺肌病的發生與發展[17，18]。

黃歐平課題組前期研究發現來自臨床確診的子宮內膜異位癥患者異位子宮內膜組織中分離、鑒定的間質細胞中DNMT3A的mRNA與蛋白表達都顯著下調;間質細胞中14-3-3ζ的mRNA及蛋白表達顯著上調，進一步的MSP結果顯示其基因啟動子CpG島存在去甲基化狀態;經轉染DNMT3A重組腺病毒表達載體、DNMT3A高水平表達的轉基因細胞中細胞增殖率及遷移率減慢，細胞凋亡增加[8]，證明子宮內膜間質細胞異常至少是誘發子宮內膜異位癥的主要原因之一，也很可能成為子宮內膜異位癥治療的新靶點。

西紅花苷是從西紅花植物中提取的活性化合物，其生物活性包括抗炎、抗氧化、抗抑郁和抗癌作用。體外多項研究顯示西紅花苷通過炎癥及免疫信號通路發揮抗炎及抗腫瘤作用。西紅花苷在誘導癌細胞凋亡、抑制其惡性增殖方面有顯著的療效。最近一項研究顯示西紅花通過miR-320/KLF5/HIF-1α信號傳導抑制胃癌細胞的EMT，遷移和侵襲[19]。Rania RM等[20]研究數據表明西紅花具有抗凋亡，抗炎和抗氧化活性，可能通過激活PI3K/Akt/mTOR軸和增強的miRNA-7和miRNA-221在魚藤酮（ROT）誘導的大鼠的帕金森病中顯示出有益的神經保護作用。本研究結果也表明，西紅花苷可以抑制子宮腺肌病間質細胞的增殖，促進其凋亡，且藥物濃度越高，效果越顯著。

最新一項研究結果顯示西紅花通過降低炎癥因子如TNF-α、PGE2、IL-1β和IL-6及其基因表達（TNF-α、COX-2、IL）的水平，對脂多糖誘導的敗血癥及其體外心臟毒性具有預防作用[21]。一項動物實驗研究將西紅花和美沙拉嗪單獨和聯合治療潰瘍性結腸炎的大鼠模型，西紅花和美沙拉嗪通過抗氧化和抗炎作用對結腸組織產生保護作用[22]。在一項研究中發現西紅花治療急性胰腺炎，調節胰腺炎性細胞因子，上調Nrf-2的表達，并下調了IL-6、TNF-α、硝基酪氨酸和NF-κB的表達，顯著降低胰腺水腫，血清淀粉酶和脂肪酶的水平[23]。免疫及炎癥因素也參與了子宮腺肌病的發病進程，西紅花苷是否能夠參與調節間質細胞的免疫功能及炎癥因子，從而對子宮腺肌病起治療作用，非常值得進一步研究。

綜上所述，本研究通過細胞功能實驗發現西紅花苷對子宮腺肌病中異位子宮內膜細胞增殖有明顯抑制作用，與藥物濃度及時間呈正比，藥物濃度越高和作用時間越長抑制作用越明顯。雙染色流式細胞術檢測發現西紅花苷可誘導子宮內膜間質細胞凋亡，與藥物濃度成正比。不同濃度的西紅花苷作用子宮內膜間質細胞，細胞周期被阻滯在G0/G1期。實驗結果表明西紅花苷能抑制子宮腺肌病灶的生長及進展。但具體的分子生物機制還需要進一步研究。

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（收稿日期：2020-03-02）