糖絡寧對糖尿病周圍神經病變大鼠細胞凋亡相關通路的影響

陳楓 郭宇鑫 王利瑩

[摘要] 目的 觀察糖絡寧對糖尿病周圍神經病變（DPN）大鼠坐骨神經組織中PI3K/AKT及PERK信號傳遞通路的調節作用。 方法 選用8周齡的清潔級雄性SD大鼠80只，隨機選擇14只為正常組，其余66只通過一次性腹腔內注射鏈脲佐菌素60 mg/kg，誘導大鼠高血糖，建造DPN大鼠實驗模型。將造模成功的61只大鼠采用隨機數字表法分為模型對照組（模型組，21只）、糖絡寧組（中藥組，21只）、α-硫辛酸治療組（西藥組，19只）。中藥組予糖絡寧5 g/（kg·d）一次灌胃，西藥組予α-硫辛酸20 mg/（kg·d）一次灌胃，模型組每天予等量蒸餾水灌胃，各組均連續用藥8周。8周后通過Western blot檢測坐骨神經中p-PI3K、p-pPI3K、p-AKT、p-pAKT、p-PERK、p-pPERK蛋白的表達。 結果 各組大鼠脊髓背根神經節（DRG）中p-PI3K、p-pPI3K、p-AKT、p-pAKT、p-PERK、p-pPERK蛋白表達比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。與正常組比較，模型組大鼠DRG中p-PI3K、p-pPI3K、p-AKT、p-pAKT蛋白表達顯著降低（P < 0.01），p-PERK、p-pPERK蛋白表達顯著升高（P < 0.01）;與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠DRG中p-PI3K、p-pPI3K、p-AKT、p-pAKT蛋白表達升高（P < 0.05），p-PERK、p-pPERK蛋白表達降低（P < 0.05）。 結論 糖絡寧可通過激活PI3K/AKT和信號傳遞通路，抑制PERK信號傳遞通路，改善神經細胞凋亡狀況，抑制神經損傷。

[關鍵詞] 糖絡寧;細胞凋亡;糖尿病周圍神經病變;信號通路

[中圖分類號] R-332? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）10（b）-0021-04

[Abstract] Objective To observe the regulatory effect of Tangluoning on PI3K/AKT and PERK signaling pathway in sciatic nerve tissue of diabetic peripheral neuropathy （DPN） rats. Methods Eighty eight-week-old male SD rats of clean grade were selected. Fourteen rats were randomly selected as normal group. The other 66 rats were induced hyperglycemia by intraperitoneal injection of streptozotocin 60 mg/kg. Sixty-one rats were randomly divided into model control group （model group， 21 rats）， Tangluoning group （traditional Chinese medicine group， 21 rats）， α-lipoic acid treatment group （Western medicine group， 19 rats）. Traditional Chinese medicine group was given Tangluoning 5 g/（kg·d）， Western medicine group was given α-lipoic acid 20 mg/（kg·d） once a day. Model group was given the same amount of distilled water by gavage every day. All groups were treated for eight weeks. After eight weeks， the expression of p-PI3K， p-pPI3K， p-AKT， p-pAKT， p-PERK and p-pPERK protein in sciatic nerve was detected by Western blot. Results The expression of p-PI3K， p-pPI3K， p-AKT， p-pAKT， p-PERK and p-pPERK protein in dorsal root ganglion （DRG） of rats in each group had statistical significance （P < 0.05）. Compared with normal group， the protein expressions of p-PI3K， p-pPI3K， p-AKT and p-pAKT in DRG of model group were significantly decreased （P < 0.01）， and the protein expressions of p-PERK and p-pPERK were significantly increased （P < 0.01）. Compared with model group， the protein expressions of p-PI3K， p-pPI3K， p-AKT and p-pAKT in the DRG of Chinese medicine group and Western medicine group were increased （P < 0.05）， and the protein expressions of p-PERK and p-pPERK were decreased （P < 0.05）. Conclusion Tangluoning can regulate PI3K/AKT and PERK signaling pathway so as to inhibiting apoptosis and avoid nerve injury.

[Key words] Tangluoning; Apoptosis; Diabetic peripheral neuropathy; Signaling pathway

我國2型糖尿病發病率逐年上升，目前患病率已達10.4%，糖尿病周圍神經病變（DPN）是其最常見的慢性并發癥之一[1]，其患病率可達50%以上[2]。DPN會導致慢性疼痛、感覺喪失、足部潰瘍和最終截肢[3]。糖尿病性神經病的病因之一可能是感覺神經元和雪旺細胞發生凋亡，甚至死亡[4]，但DPN病因機制更為復雜，免疫機制、遺傳基因機制等均與DPN的發病有關[5]。臨床研究表明，糖絡寧對DPN的治療效果明顯[6-7]，但其作用機制尚待研究。本研究通過觀察糖絡寧對DPN大鼠坐骨神經中的PI3K/AKT及PERK信號通路表達的影響，探討其治療DPN的作用機制。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性8周齡大鼠SD大鼠80只，體重（225±25）g，合格證書編號：SCXK（京）2012-0001，由中國北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。購入后于北京中醫藥大學動物實驗中心飼養，實驗室條件：國標GB14925-2001規定動物實驗設施大鼠SPF級屏障環境[環境安全合格證號：SYXK（京）2011-0024]，實驗中心溫度（20±2）℃，濕度45%～65%，12 h明暗交替照明。實驗前大鼠適應性喂養2周。實驗程序由北京中醫藥大學東方醫院醫學倫理委員會論證通過。

1.2 藥物與試劑

鏈脲佐菌素（美國Merck公司，批號：B69776）;α-硫辛酸（批號：82159-09-9），兔抗大鼠ART多克隆抗體（貨號：4685），兔抗大鼠磷酸化ART（p-pART）多克隆抗體（貨號：4060），兔抗大鼠PI3 Kinase p85（Tyr458）/p55（Tyr199）多克隆抗體（貨號：4257），兔抗大鼠磷酸化PI3 Kinase p85（Tyr458）/p55（Tyr199）（貨號：4228），兔抗大鼠細胞PERK多克隆抗體（貨號：3192），兔抗大鼠磷酸化PERK單克隆抗體（貨號：3179），以上試劑均購自美國CST公司;糖絡寧制劑（北京中醫藥大學東方醫院制劑室自制，約為生藥10 g/mL，方藥組成：牛膝、丹參、生黃芪、全蝎、狗脊等）。

1.3 造模、分組與給藥方式

參照既往研究[6-9]進行造模、分組及給藥等處理。選用8周雄性SD大鼠80只，造模前隨機選擇14只為正常組，剩余66只予鏈脲佐菌素60 mg/kg進行腹腔注射，72 h后隨機測定其血糖≥16.7 mmol/L則造模成功。將成模大鼠61只采用隨機數字表法分為三組：西藥組（19只）、中藥組（21只）、模型組（21只）。中藥組每只大鼠給予糖絡寧制劑5 g/（kg·d）進行灌胃;西藥組將2.5 mg/mL α-硫辛酸用等量蒸餾水調配，每只大鼠予20 mg/（kg·d）進行灌胃;模型組予等量蒸餾水進行灌胃。連續給藥8周。實驗期間大鼠自由飲食。因大鼠死亡，模型組、西藥組、中藥組最終剩余大鼠數量分別為17、18、18只。由于神經組織取材困難，故在實驗結束時統一進行取材。

1.4 脊髓背根神經節（DRG）神經組織取材及線粒體提取

DRG神經組織取材均參照既往研究[6-9]，最終提取樣本放進-80℃冰箱備用。

1.5 Western blot檢測PI3K、AKT、PERK的表達

于-80℃冰箱中提取DRG神經組織，冰浴下組織勻漿，提取蛋白，按BCA法定量，保證每個樣品的蛋白量。每個樣品蛋白量均為40 μg。進行制膠與上樣后進行電泳與轉模。按濃縮膠80 V、分離膠120 V進行恒壓電泳，按300 mA恒流轉膜電泳，持續時間根據目的蛋白分子量進行調整。于室溫封閉液中加入已經轉膜完成的膜，封閉1 h，再加入已溶液稀釋好的一抗（以1000∶1比例混合5%BSA與兔抗p-PI3K、p-pPI3K、p-AKT、p-pAKT、p-PERK、p-pPERK）4℃過夜，之后用TBST清洗5 min，共3次，加入稀釋好的二抗（以比例10 000∶1混合5%脫脂牛奶與山羊抗兔第二抗體），室溫下靜置30 min后，在搖床上用TBST清洗5 min，共4次。操作完成后，將其在暗室中曝光，掃描膠片圖像，進行存檔。對膠片目標帶通過Alpha Ease FC 4.0進行分析，檢測吸光度值。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件處理數據，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t、SNK-q檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組大鼠DRG中p-PI3K、p-pPI3K、p-AKT、p-pAKT、p-PERK、p-pPERK蛋白表達比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。與正常組比較，模型組大鼠DRG中p-PI3K、p-pPI3K、p-AKT、p-pAKT蛋白表達顯著降低（P < 0.01），p-PERK、p-pPERK蛋白表達顯著升高（P < 0.01）;與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠DRG中p-PI3K、p-pPI3K、p-AKT、p-pAKT蛋白表達升高（P < 0.05），p-PERK、p-pPERK蛋白表達降低（P < 0.05）。見表1、圖1～2。

3 討論

中醫學方面雖無糖尿病周圍神經病這一病名，但其表現手足麻木、腿膝肌肉枯細、肢體酸軟痿痹等臨床癥狀與現代中醫“痹證”“痿證”相似。因繼發于消渴病，因此有人稱之為消渴病、痹病。也有研究從經絡學說角度論述本病，提出益氣補腎、化瘀活血通絡的基本治法[10]。在臨床治療上，應針對本病“氣陰兩虛，血脈不暢，氣滯血瘀，絡脈瘀阻”的臨床病理變化特點，以“益氣養陰，化瘀通絡”為治則。中藥糖絡寧由牛膝、丹參、生黃芪、全蝎、狗脊等藥組成，全方益氣養陰而使血脈暢達，通痹活血止痛而無破血傷陰。十余年來，糖洛寧在臨床上治療DNP的效果確切，然而其作用機制尚待研究。糖絡寧有改善線粒體抗氧化劑的活性作用[7]，可明顯抑制神經細胞線粒體DNA的過度表達，對神經細胞凋亡狀況有較好的改善和治療效果。

研究發現，周圍神經細胞的凋亡是DPN的重要發病原因之一[10-11]。神經細胞受損后發生凋亡的機制涉及眾多途徑，PI3K/AKT信號通路是其中之一[12]。PI3K/AKT信號通路參與體內糖代謝的調控，是高血糖和細胞凋亡的一個細胞內靶點[13-14]。胰島素樣生長因子-1的激活誘導PI3K/AKT途徑磷酸化和促進抗凋亡蛋白、增殖細胞核抗原和細胞周期蛋白表達，可能促進雪旺細胞增殖和神經再生，有助于修復受損的周圍神經[15]。DPN的發病機制絕非單一，內質網應激所誘導神經細胞凋亡是DPN發病的重要機制之一[16-18]。有研究[19-21]表明，DPN的發生可能與內質網應激分子PERK有關。PERK是一種跨膜糖蛋白，為ER特有。未折疊或折疊錯誤的蛋白會誘導PERK表達升高和促磷酸化，從而抑制鳥嘌呤eIF2β，使其從活性GTP結合的形式還原為eIF2，促使mRNA翻譯停止[22]。PERK的表達升高和促磷酸化還促進C/EBP同源蛋白的表達，同時還可激動死亡蛋白酶caspase-12，從而使細胞凋亡速度加快，導致DPN的發生。

總之，持續的高血糖狀態會抑制PI3K/AKT信號傳遞通路和激活PERK通路，加速細胞凋亡，最終造成神經損傷。作為一個臨床效果顯著的中藥復方，糖絡寧可以促進PI3K/AKT信號傳遞通路和抑制PERK通路，抑制細胞凋亡，改善神經細胞損傷，這可能是糖絡寧治療DPN的機制之一。

[參考文獻]

[1]? 中華醫學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南（2017年版）[J].中華糖尿病雜志，2018，10（1）：4-67.

[2]? Finnerup NB，Attal N，Haroutounian S，et al. Pharmacotherapy for neuropathic pain in adults：a systematic review and meta-nalysis [J]. Lancet Neurol，2015，14（2）：162-173.

[3]? Ozaki K，Terayama Y， Matsuura T，et al. Effect of combined dyslipidemia and hyperglycemia on diabetic peripheral neuropathy in alloxan induced diabetic WBN/Kob rats [J]. J Toxicol Pathol，2018，31（2）：125-133.

[4]? Cinci L，Corti F，Di Cesare Mannelli L，et al. Oxidative，metabolic，and apoptotic responses of Schwann cells to high glucose levels [J]. J Biochem Mol Toxicol，2015，29（6）：274-279.

[5]? 黃海倫，吳珊.糖尿病周圍神經病相關發病機制研究進展[J].中華腦科疾病與康復雜志，2019，9（3）：176-180.

[6]? 張濤靜，龔燕冰，周暉，等.糖絡寧對STZ誘導糖尿病大鼠背根神經節線粒體呼吸鏈復合物的影響[J].北京中醫藥，2013，32（8）：621-624.

[7]? 張濤靜，龔燕冰，周暉，等.糖絡寧對STZ誘導糖尿病大鼠背根神經節線粒體抗氧化劑活性的影響[J].疑難病雜志，2015，14（2）：179-181.

[8]? 張濤靜，高彥彬，龔燕冰，等.糖絡寧對糖尿病大鼠背根神經節線粒體DNA及電鏡下線粒體結構的影響[J].中國醫藥導報，2016，13（11）：4-8.

[9]? 郭宇鑫，王利瑩，李逸瀟，等.糖絡寧對糖尿病大鼠周圍神經病變氧化應激相關通路的影響[J].北京中醫藥大學學報，2018，37（11）：1018-1021.

[10]? El-Horany HE，Watany MM，Hagag RY，et al. Expression of LRP1 and CHOP genes associated with peripheral neuropathy in type 2 diabetes mellitus：correlations with nerve conduction studies [J]. Gene，2019，702：114-122.

[11]? Sadeghiyan Galeshkalami N，Abdollahi M，Najafi R，et al. Alpha-lipoic acid and coenzyme Q10 combination ameliorates experimental diabetic neuropathy by modulating oxidative stress and apoptosis [J]. Life Sci，2019，216：101-110.

[12]? Chang Y，Huang W，Sun Q，et al. MicroRNA-634 alters nerve apoptosis via the PI3K/Akt pathway in cerebral infarction [J]. Int J Mol Med，2018，42（4）：2145-2154.

[13]? Dong P，Zhang X，Zhao J，et al. Anti-microRNA-132 causes sevofluraneinduced neuronal apoptosis via the P13K/AKT/FOX03a pathway [J]. Int J Mol Med，2018，42（6）：3238-3246.