補腎活血方調節COX-2、PGE2改善不明原因復發性流產患者分泌晚期蛻膜化水平的研究

馮曉玲，朱慧，常卓，張揚，蔣莎，谷玥儒，賈紫千，吳儀

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

復發性流產(Recurrent spontaneous abortion，RSA)是指與同一性伴侶妊娠20周前，連續發生2次或2次以上的自然流產。其發病機制較為復雜，排除已知的病因，如解剖學因素、遺傳因素、免疫因素、內分泌因素和感染因素等，仍有近40%～60%RSA是病因未知的，被稱為不明原因復發性流產(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[1-2]。近年來有研究認為，RSA的發病與子宮內膜的蛻膜化缺陷相關[3]。蛻膜化是月經發生的前提，在正常月經周期第23～24天時，子宮內膜間質細胞開始蛻膜化，于月經周期第28天蛻膜化基本完成由間質細胞向蛻膜基質細胞的轉化。蛻膜化過程順利是胚胎植入、胎盤形成及妊娠維持的必備條件[4]。催乳素(Prolactin，PRL)和胰島素樣生長因子結合蛋白-1(Insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)是衡量子宮內膜蛻膜化水平的重要指標，可調控子宮內膜上皮的分化及胚胎滋養層細胞的功能，防止受精卵氧化，以維持妊娠[5]。環氧合酶-2(COX-2)表達于著床前胚胎的滋養外胚層細胞，能調控花生四烯酸產生前列腺素E2(PGE2)[6]。研究表明，兩者均參與妊娠早期子宮內膜蛻膜化和胚胎植入過程，影響胚胎著床、發育直至分娩，對女性生殖起到重要調控作用[7]。本文研究旨在明確URSA患者中COX-2、PGE2、蛻膜化水平的變化，并探索補腎活血方對URSA分泌晚期COX-2、PGE2、PRL及IGFBP-1水平的影響，從而在分子層面探究補腎活血方治療URSA的作用機制，為URSA疾病的病因學研究提供新思路，并對URSA疾病的臨床防治具有一定指導意義，值得推廣應用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年3月—2019年2月在黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院門診及住院部治療的符合納入標準的腎虛血瘀型URSA患者共110例，其中現妊娠失敗需行清宮術患者 15 例(試驗組1)，正常妊娠要求行人工流產術者 15 例(對照組1)，共收集蛻膜樣本 30 例。試驗組1年齡平均(32.33±4.74)歲，孕周平均(9.30±1.75)周，對照組1年齡平均(33.80±3.74)歲，孕周平均(8.48±1.44)周，兩組受試者停經周數、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。未孕患者80例(數字隨機法平均分為2組：試驗組2給予補腎活血方，對照組2給予阿司匹林)。其中試驗組2排除5例，對照組2排除20例，未計入統計數據。試驗組2和對照組2年齡平均(30.75±4.02)歲，另選取正常未孕女性40例(空白組),空白組年齡平均(33.8±3.74)歲，各組受試者年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。納入、排除、脫落、剔除標準見參考文獻[8]。本實驗已獲得黑龍江中醫藥大學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

DEPC原液(廣州市藍博生物技術有限公司);TRLZOL Reagents(美國Invitrogen公司);無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司);三氯甲烷(天津市博迪化工有限公司);異丙醇(天津市富宇精細化工有限公司);Human COX-2 Elisa kit試劑盒、Human PGE2 Elisa kit 試劑盒、Human IGFBP-1 Elisa kit試劑盒、Human PRL Elisa kit試劑盒等(碧云天生物公司)。

1.3 主要儀器

高速組織勻漿器T1000(德國IKA公司)；高速冷凍離心機(美國BECKMANCOULTER 公司、型號：Alegra 21R);羅氏實時定量 PCR 儀(美國 ThermoFisher Scientific公司);全自動酶標儀(BioTek Instruments.Inc，型號：ELX808);318W型洗板機(上海三科儀器有限公司)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 RT-PCR法檢測蛻膜中COX2、PGE2、PRL、IGFBP-1的mRNA

收集蛻膜，立即用無菌生理鹽水沖洗，用無菌剪刀剪去血塊，放入無菌器皿中，使用液氮迅速冷凍，放置在實驗室-80℃冰箱中保存。

提取RNA(在冰上進行)并測定純度。反轉錄嚴格按照美國 Thermo Scientific公司的反轉錄試劑盒說明書進行。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(PGE2：F 5'ATGGGACCTCCAAGCTCTTAG3'，R 5'GGAAGTTTGTGTTGCATCTTGTGT3'。COX-2：F 5'AGCAGGCAGATGAAATACCAGTCT3'，R 5'ATACAGCTCCACAGCATCGATGT3'。PRL：F 5'ATGGAAGTCCCGACCAGAC3'，R 5'ATTGAGGAGCAAACCAAACG3'。IGFBP-1：F 5'CTGCGTGCAGGAGTCTGA3'，R 5'CCCAAAGGATGGAATGATCC3'。GAPDH：F 5'ACAGTCAGCCGCATCTTC3'，R 5'CTCCGACCTTCACCTTCC3')。使用BIOTOOL的2x SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒，反應條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，40Cycles；60 ℃，30 s。反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線。通過比較Ct方法定量結果，并且靶基因的相對表達量用2-ΔΔCt表示。

1.4.2 ELISA法檢測血清COX2、PGE2、PRL、IGFBP-1水平

試驗組2、對照組2和空白組入組后月經第26天抽取靜脈血，分離血清后凍存備用，隨即試驗組2給予補腎活血方(丹參15 g，桑寄生15 g，菟絲子15 g，黃芪15 g，續斷15 g，阿膠10 g)，每日100 mL水煎服，早晚分服(中藥湯劑由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥局和煎藥室提供)。對照組2給予阿司匹林，100 mg/日口服(意大利Bayer S.p.A.公司)。4周后再次留取靜脈血，分離血清凍存。

常溫解凍血清，標記10孔的標準品于酶標板上，稀釋濃度分別為：90，60，30，15，7.5 U/L(COX-2試劑盒)；360，240，120，60，30 ng/mL(PGE2試劑盒)；18，12，6，3，1.5 ng/mL(PRL試劑盒)；18，12，6，3，1.5 ng/mL(IGFBP -1試劑盒)。加入需測定樣品10 μL，37 ℃溫育30 min；棄去酶標板中的液體，晾干，而后將洗滌液加入所有孔中，靜置30 s，棄液，重復5次；在樣品孔中加入50 μL的酶標試劑，用移液器重復吹打多次直至其混合均勻，重復溫育、洗滌；將50 μL的顯色劑A、B依次加入微孔中，混合均勻，避光，37 ℃條件下顯色15 min；于每個微孔中加入 50 μL終止液終止反應；使用ELX808全自動酶標儀，在450 nm波長條件下，依照次序測量每個微孔的OD值。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 蛻膜組織中COX-2、PGE2、PRL、IGFBP-1的mRNA 水平比較

試驗組1蛻膜組織中COX-2、PGE2、PRL、IGFBP-1的mRNA水平均低于對照組1，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 試驗組1和對照組1蛻膜組織中 COX-2、PGE2、PRL、IGFBP-1的mRNA水平比較

2.2 血清中COX-2、PGE2、PRL、IGFBP-1水平比較

治療前試驗組2和對照組2血清COX2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；試驗組2治療后血清COX2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平表達與治療前相比升高，差異有統計學意義(P<0.05)；治療后試驗組2血清COX2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平高于對照組2，差異有統計學意義(P<0.05)(見表2)。治療后試驗組2和對照組2相比血清COX2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平更接近于空白組(見圖1)。

表2 試驗組2和對照組2血清COX-2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平比較

圖1 各組血清COX-2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平比較

2.3 COX-2、PGE2與蛻膜化因子PRL、IGFBP-1相關性

COX-2、PGE2與蛻膜化因子PRL、IGFBP-1之間存在顯著且有統計學意義的相關性(P<0.05，見表3)。

表3 COX-2、PGE2與蛻膜化因子PRL、IGFBP-1相關性比較

3 討論

復發性流產為當代育齡期女性常見疾病，且其發病率呈逐年上升趨勢，嚴重影響女性身心健康。復發性流產病因、病機復雜，包括夫妻雙方及胚胎染色體異常、內分泌失調、免疫因素、胚胎種植部位及生殖道結構異常、生殖道感染、血栓前狀態等因素相關[9]。子宮內膜蛻膜化是指子宮內膜基質細胞受到蛻膜化誘導因子的刺激，使子宮內膜增殖分化成特殊組織，有利于胚胎的植入及胎盤的形成，是維持妊娠的必須條件[10]。女性子宮內膜的周期性改變是先天性的生物學特征，同理處于這種循環中的重要一節的蛻膜化改變屬于自動發生的，與女性是否受孕無關；子宮內膜蛻膜化后的發展可分為2種：若女性未受孕，蛻膜化的內膜由于黃體的萎縮導致的激素水平突然降低而出現的撤退性出血，月經期過后，子宮內膜立即進入下一個周期；若卵子與精子成功結合，女性受孕，則蛻膜化的內膜繼續增殖和分泌，為接下來的胚胎植入和胎盤發育做準備，形成母胎界面中母體面的主要成分；有研究人員認為，子宮內膜蛻膜化是早孕是否成功的關鍵因素之一[11]。子宮內膜蛻膜化對女性妊娠有著至關重要的作用，如楊慧等人通過體外誘導正常人和RSA患者內膜基質細胞蛻膜化進行對比研究，它們認為復發性自然流產的發生發展的重要原因，即蛻膜化異常[12]。目前，PRL及IGFBP-1已被廣泛認可為衡量蛻膜化水平的標志性指標[13]。PRL由垂體分泌，作用于妊娠黃體，一定量的PRL，能促進子宮內膜蛻膜化形成，增加子宮內膜容受性，避免母胎排斥，是維持妊娠的關鍵。同時，PRL也是蛻膜化的產物，分化良好的蛻膜基質細胞又可以分泌更多的PRL，維持妊娠[14]。IGFBP-1是分泌期子宮內膜的產物，在蛻膜化基質細胞中表達[15]，調控子宮內膜基底細胞有絲分裂，既作為蛻膜化產物，又可促進和維持蛻膜化水平。

環氧合酶COX是參與前列腺素及其衍生物合成的重要限速酶，包括COX-1、COX-2和COX-3同工酶，其中COX-2的表達對胚胎的種植及蛻膜化起到促進作用，其水平隨著滋養細胞的侵入不斷增加，因此COX-2的高表達是維持妊娠的重要條件。COX-2屬于誘導型，是一種即刻早期反應基因，在多數組織中不體現，活性較為穩定，但在一些應激刺激條件下活性度增高，產生一系列反應物質參與人體生理或病理活動[16]；如通過COX-2缺陷雌性小鼠的實驗發現，COX-2表達異常會引起排卵障礙、蛻膜化不完全、胚胎著床失敗和復發性流產等疾病[17]。COX-2催化花生四希酸產生的PGE2，可促進胚胎種植部位血管再生及局部血流量增加[18-19]。前列腺素廣泛存在于人體多種組織中，如卵巢、子宮、肝臟、血小板、紅細胞等，并且不同器官中不同時期前列腺素的功能不同，且在分泌晚期PGE2及其信號通路上游物質COX-2含量顯著增加[20]；PGE2是調節子宮肌肉收縮的有效刺激物，若PGE2表達異常會導致子宮收縮調節失衡，繼而異常子宮出血、痛經、不孕癥、復發性流產等疾病出現的可能性增加[21]；于浩等人認為COX-2是子宮內膜蛻膜化進程中的關鍵影響因素[22]；COX-2催化出的PGE2能夠增加子宮內膜血管通透性，參與蛻膜化的過程[23]。紀蓓蓓等人發現，在未孕女性外周血清中可測得PGE2，并可作為差異性比價的標準，且未孕女性外周血中PGE2濃度與孕期女性相比有明顯差異[24]。有研究報告稱，在反復妊娠失敗的著床期子宮內膜中監測出COX-2，并與流產密切相關[25]。試驗結果顯示腎虛血瘀型不明原因復發性流產患者的流產蛻膜組織中COX-2、PGE2、IGFBP-1、PRL的表達水平較正常女性低；COX-2、PGE2與蛻膜化因子PRL、IGFBP-1之間存在顯著且有統計學意義的相關性，證實了URSA患者的低蛻膜化水平與COX-2、PGE2的低表達相關，推測兩者變化可能會影響蛻膜化水平。

中醫將URSA歸屬于“滑胎”范疇，腎為先天之本，主藏精氣，可固攝胎元，腎虛為滑胎的根本，腎虛沖任不固，系胎無力，則屢孕屢墮。血瘀則胞脈氣血運行不暢，瘀血阻滯，新血不能下注胞胎而胎失所養、胎元不實。在子宮內膜蛻膜化過程中，經常觀察到大量的血管重塑，細胞增殖和分化，以及分泌的突然增加等[5]。現代研究認為腎虛血瘀型URSA為血栓前狀態所致，引起蛻膜及胎盤微血栓形成，影響胎盤血供，形成絨毛膜后或蛻膜下血腫，刺激子宮收縮而誘發流產[26]。補腎活血方具有促進血液流通，維持分泌功能，防止免疫異常導致的損傷；補充腎氣，促進氣血流通，改善血瘀狀態；促進蛻膜化的正常進展，推動其生長發展，維持子宮環境的平衡，抑制針對胎兒的母體免疫排斥[27]。西醫多應用阿司匹林抗血栓形成，對其用于治療URSA仍存在爭議。中醫認為URSA患者多以腎虛為本，血瘀為標，治則以補腎祛瘀，活血安胎為主。補腎活血方：丹參15 g，桑寄生15 g，菟絲子15 g，黃芪15 g，續斷15 g，阿膠(烊化)10 g。方中丹參，活血祛瘀，具有抗血栓、改善微循環的作用；菟絲子、續斷、桑寄生，補腎安胎, 可調節生殖系統、抑制宮縮、抗凝血等；黃芪、阿膠補氣養血，促進血液流通。觀察結果顯示，補腎活血方治療后，腎虛血瘀型不明原因復發性流產未孕患者分泌晚期血清中COX-2、PGE2、IGFBP-1、PRL表達水平較入組時顯著提高，與正常女性相比無明顯差別。

綜上所述，同正常女性相比URSA患者蛻膜化水平較低，可能與COX-2、PGE2表達異常降低有關。補腎活血方體內干預可在未孕時提高血清中COX-2、PGE2、IGFBP-1、PRL水平，改善蛻膜化進程，提高蛻膜化水平，從而達到補腎活血，祛瘀安胎的目的，利于妊娠的維持。